裴宇盛 ，蔡 彤 △，陳 晨 ，高 華 ，魏 霞 ，劉 洋 ，王婷婷 ，祝清芬 ，陸益紅 ，樸晉華 ，劉 琦 ，張 蕻 ，李松梅

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629； 2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101； 3.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210019； 4.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001）

重組C因子法是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充替代方法，原理是將鱟試劑中的C因子采用生物技術(shù)重組獲得，用來(lái)替代海洋生物鱟作為鱟試劑原料唯一來(lái)源。該方法的推廣使用，可保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減緩鱟資源枯竭速度[1]。由于鱟資源僅分布于中國(guó)及東南亞一帶和美國(guó)西海岸，我國(guó)鱟資源近年逐漸衰減[2]，以廈門(mén)為例，20世紀(jì)90年代與20世紀(jì)50年代相比，鱟資源減少了80% ～90%，現(xiàn)在主要棲息于人工建立的保護(hù)區(qū)[3]。歐洲大陸的動(dòng)物保護(hù)主義理念的深入推廣，如3R理論（對(duì)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)應(yīng)減少、優(yōu)化、替代），歐洲官方對(duì)重組C因子法認(rèn)可先于世界其他各國(guó)，根據(jù)歐洲藥典會(huì)第160次會(huì)議決定，啟動(dòng)將重組C因子法單獨(dú)作為正文方法（目錄號(hào)為2.6.32）的工作程序。美國(guó)食品藥物管理局(FDA)在2012年發(fā)布的指導(dǎo)原則中，將重組C因子法列為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的補(bǔ)充替代方法。我國(guó)目前對(duì)重組C因子法的法定地位尚未明確，制備研究逐漸增多[4－7]，但有關(guān)重組 C 因子應(yīng)用的研究較少[8－9]。

本研究中重點(diǎn)考察重組C因子法的品種適用性，選取了有代表性的6個(gè)典型品種，每個(gè)品種3個(gè)批次，進(jìn)行重組C因子法干擾試驗(yàn)，并經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)3個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。以回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以2015年版《中國(guó)藥典》為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，并將4個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該方法過(guò)程中產(chǎn)生的問(wèn)題和解決方法進(jìn)行總結(jié)，給擬采用該方法的實(shí)驗(yàn)室提供相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，以加快該方法在我國(guó)的應(yīng)用推廣?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SynergyHT型多功能酶標(biāo)儀（加拿大Biotek生物技術(shù)公司）；1389 A2型生物安全柜（美國(guó)Thermo有限公司）。

1.2 試藥

重組C因子試劑盒（Lonza，貨號(hào)為50－658U，批號(hào)為 0000591563；Hyglos GmbH，貨號(hào)為 609033，批號(hào)為17620）。干擾試驗(yàn)樣品，注射用重組人干擾素 α－1b（深圳科興生物工程有限公司，批號(hào)為 201504022，201503008；北京三元基因工程有限公司，批號(hào)為20141005；品種1）；注射用磺芐西林鈉（?？谄媪χ扑幑煞萦邢薰荆?hào)為20140902；湖南爾康湘藥制藥有限公司，批號(hào)為140709－4；瑞陽(yáng)制藥有限公司，批號(hào)為15022602；品種2）；消癌平注射液（南京圣和藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為 201510151，201510211，201603171，品種3）；凍干人用狂犬病疫苗（vero細(xì)胞，遼寧成大生物制品有限公司，批號(hào)分別為 201407210，201407212，201407206，品種4）；甘精胰島素注射液（山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，批號(hào)為201509c003；遼寧博鰲生物制藥有限公司，批號(hào)為20150310；珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號(hào)為 20155082Z8A005B；品種 5）；赫賽?。ㄉ虾Ａ_氏制藥有限公司，批號(hào)分別為 N3742，N3749，N3753，品種 6）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

儀器靈敏度調(diào)節(jié)：靈敏度調(diào)節(jié)試驗(yàn)為預(yù)試驗(yàn)，將儀器的靈敏度調(diào)整到適合范圍，充分發(fā)揮試劑的檢測(cè)能力。標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證試驗(yàn)是各個(gè)國(guó)家藥典中規(guī)定的方法轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，用以證明該實(shí)驗(yàn)室可以操作重組C因子法。干擾試驗(yàn)是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，用以驗(yàn)證樣品能否用于重組C因子法檢測(cè)。

品種選擇依據(jù)：為了驗(yàn)證重組C因子法的品種適用性，選取了有代表性的6個(gè)典型品種，包括抗生素、生化藥品、重組技術(shù)產(chǎn)品、中藥注射液、病毒疫苗和單克隆抗體。中國(guó)食品藥品檢定研究院為實(shí)驗(yàn)室1，山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院為實(shí)驗(yàn)室2，江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院為實(shí)驗(yàn)室3，山西省食品藥品檢驗(yàn)所為實(shí)驗(yàn)室 4。

2.2 儀器靈敏度調(diào)節(jié)

使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和檢查用水，配制濃度為0.5 EU／mL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，每步稀釋混勻時(shí)間不少于1 min。設(shè)置儀器參數(shù)：激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)為380 nm和440 nm；溫度為37℃；2次讀數(shù)之間間隔1 h；光學(xué)位置為底部；靈敏度（增益值）分別設(shè)為 35，40，45，50，55，60，65，70，75，80。加樣：0.5 EU ／mL 平行 4 孔，每孔 100 μL，加入酶標(biāo)板，在37℃孵育10 min。配制檢測(cè)試劑：按順序?qū)晒獾孜?、重組C因子緩沖液、重組C因子酶，按5 ∶4 ∶1（Hyglos的試劑按 1 ∶8 ∶1）比例充分、輕柔混合。混合后的檢測(cè)試劑須立即使用，不能保存。加樣：將每孔中加入0.1 mL配制好的檢測(cè)試劑，震板10 s。按上述儀器參數(shù)設(shè)置分別于時(shí)間零點(diǎn)和1 h點(diǎn)讀數(shù)。時(shí)間零點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果記為 RFU（0），在 37℃孵育 1 h后，再次檢測(cè)結(jié)果記為 RFU（1 h）。按公式 logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]計(jì)算。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：選取 logδRFU 平均值最接近3.5的靈敏度作為試驗(yàn)靈敏度。

儀器靈敏度調(diào)節(jié)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，當(dāng)增益值為 60 時(shí)，logδRFU（Lonza）為 3.61，最接近 3.5，因此使用Lonza試劑時(shí)將儀器靈敏度（增益值）設(shè)定為60。當(dāng)增益值為 65 時(shí)，logδRFU（Hyglos）為 3.48，最接近3.5，因此使用Hyglos試劑時(shí)將儀器靈敏度（增益值）設(shè)定為65。

表1 儀器靈敏度（增益值）調(diào)整試驗(yàn)結(jié)果

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證

使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和檢查用水，配制濃度為5，0.5，0.05，0.005 EU ／mL 的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，每步稀釋混勻時(shí)間不少于1 min。另準(zhǔn)備細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.2 mL作為陰性對(duì)照。儀器參數(shù)設(shè)置同上。靈敏度根據(jù)2.2項(xiàng)下操作確定。配制檢測(cè)試劑步驟同2.2項(xiàng)下操作。每個(gè)濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素平行做3孔，陰性對(duì)照平行做 2孔。加樣步驟同2.2項(xiàng)下操作，完成后按公式logδRFU ＝log[RFU（1 h）－log RFU（0）]計(jì) 算 每 孔 的logδRFU，以logδRFU對(duì)內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值進(jìn)行線性擬合，按《中國(guó)藥典》要求，｜r｜＞ 0.980 即判定為標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證試驗(yàn)符合規(guī)定。結(jié)果顯示，4個(gè)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證試驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定，陰性對(duì)照值均低于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)(r＝0.999)，表明4個(gè)實(shí)驗(yàn)室均能重復(fù)重組C因子法，符合方法確認(rèn)規(guī)定。

2.4 干擾試驗(yàn)

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室均按2.3項(xiàng)下方法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體品種名稱、稀釋處理方法、限度等見(jiàn)表2。供試品陽(yáng)性對(duì)照（回收試驗(yàn)）中，添加的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度為0.5 EU／mL。每個(gè)品種3批，采用2個(gè)廠家的重組C因子試劑，每個(gè)試驗(yàn)平行2管，進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究，線性范圍為（0.005～5 EU ／mL）。

表2 6個(gè)品種的試驗(yàn)信息

干擾試驗(yàn)（回收率）結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果顯示，2個(gè)廠家生產(chǎn)的重組C因子試劑，每個(gè)品種3批，6個(gè)典型品種共計(jì)18批次，4個(gè)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室的所有回收率均在50% ～200%范圍內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。表明以上6個(gè)品種按表2中的處理方法均可使用重組C因子法進(jìn)行檢測(cè)，且重復(fù)性較好，表明該6個(gè)品種在我國(guó)能使用重組C因子法進(jìn)行日常質(zhì)量控制。干擾試驗(yàn)（內(nèi)毒素檢測(cè)值）結(jié)果見(jiàn)表4。4個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致。

表3 18批次樣品干擾試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.5 常見(jiàn)問(wèn)題與解決策略

4個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用重組C因子法過(guò)程中產(chǎn)生的問(wèn)題和解決策略見(jiàn)表5。常見(jiàn)問(wèn)題劃分為7類21條目，可供擬開(kāi)展重組C因子法檢測(cè)內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)室參考。

3 討論

3.1 重組C因子法與細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的關(guān)系

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法根據(jù)《中國(guó)藥典》可分為凝膠法和光度測(cè)定法。光度測(cè)定法又分為動(dòng)態(tài)濁度法、終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)顯色法、終點(diǎn)顯色法共4種。重組C因子法如收錄在《中國(guó)藥典》中，按此種分類模式應(yīng)稱為終點(diǎn)熒光法，應(yīng)算作光度測(cè)定法中的1種。其操作模式與其他4種光度測(cè)定法也很接近，只是由于熒光法的特點(diǎn)，需要預(yù)先試驗(yàn)確定儀器的增益值（靈敏度）。作為鱟試劑的重組替代品，從生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)，應(yīng)比自然提取的鱟試劑生物變異更小，有利于方法的標(biāo)準(zhǔn)化。

表4 18批次樣品內(nèi)毒素檢測(cè)值

3.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法與重組C因子檢查法的誤差

內(nèi)毒素檢查法的誤差問(wèn)題是重要特點(diǎn)。內(nèi)毒素檢查法被各個(gè)國(guó)家藥典及國(guó)際藥典所收載。各個(gè)國(guó)家藥典中內(nèi)毒素檢查法內(nèi)容趨于一致。而其針對(duì)靈敏度復(fù)核、凝膠法干擾試驗(yàn)、光度法干擾試驗(yàn)回收率對(duì)于結(jié)果的誤差均規(guī)定為50% ～200%即符合規(guī)定[10]。因此重組C因子法作為內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充替代方法，其結(jié)果誤差的允許范圍也遵從此規(guī)定，本研究中的干擾試驗(yàn)結(jié)果也是參考本標(biāo)準(zhǔn)。隨著內(nèi)毒素檢查法和重組C因子法的廣泛應(yīng)用與推廣，當(dāng)產(chǎn)品內(nèi)毒素含量處于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)邊緣時(shí)，更易出現(xiàn)超標(biāo)結(jié)果[11]。因此，藥品生產(chǎn)企業(yè)在進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí)，要盡量降低產(chǎn)品中的內(nèi)毒素水平，以免造成檢測(cè)結(jié)果爭(zhēng)議[12－13]。

3.3 各種方法的干擾試驗(yàn)

由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中收載的6種方法，根據(jù)歐洲藥典收載細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則，顯色法由于與凝膠法和濁度法反應(yīng)機(jī)理不同[14－15]，因此不能將凝膠法和濁度法的干擾試驗(yàn)結(jié)論直接外推至顯色法。由此推斷重組C因子法因采用了熒光反應(yīng)，同樣不能將干擾試驗(yàn)的結(jié)論外推到其他方法，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證[16]。本研究中選擇的6個(gè)典型品種具有一定代表性，可見(jiàn)重組C因子法在品種應(yīng)用方面具有一定通用性。本研究中也為《中國(guó)藥典》收載重組C因子法提供了品種應(yīng)用方面的數(shù)據(jù)支持。

表5 重組C因子法應(yīng)用常見(jiàn)問(wèn)題與解決策略匯總