李 爽，晏雪梅，肖 純，李秀芳

（云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

上呼吸道感染通常具有自限性特點，患者經(jīng)過1周左右的休息即可恢復(fù)。但對于新生兒、老年人或患有代謝性疾病的患者，則容易出現(xiàn)上呼吸道感染向下發(fā)展的情況，嚴(yán)重者可引發(fā)肺炎等并發(fā)癥[1－3]。上呼吸道是機(jī)體直接與外界相通的門戶，覆蓋于除鼻前庭外鼻腔結(jié)構(gòu)的鼻黏膜，是機(jī)體與吸入抗原、異物、微生物等接觸的第1個部位，鼻黏膜不僅具有一般的物理屏障功能，還是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，也是連接機(jī)體固有免疫與獲得性免疫的橋梁。因此，由鼻黏膜激發(fā)的免疫效應(yīng)對于防御病原體經(jīng)鼻進(jìn)入機(jī)體至關(guān)重要。急性上呼吸道感染絕大多數(shù)與鼻病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等病毒感染有關(guān)，亦可由肺炎支原體、溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌等直接引起或繼發(fā)感染[4]。也有研究表明，鼻黏膜屏障被破壞或其免疫功能低下是上呼吸道感染發(fā)生的重要原因[5－6]。鼻黏膜屏障主要由物理屏障和免疫屏障構(gòu)成，其中細(xì)胞間緊密連接（tight junction，TJ)作為鼻黏膜物理屏障的組成部分，在維持上呼吸道黏膜屏障的完整性中發(fā)揮了極為重要的作用。

緊密連接是上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間一種重要的黏附形式，主要是呈連續(xù)的帶狀結(jié)構(gòu)圍繞著上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞[7]。緊密連接具有較復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，其主要作用是通過旁細(xì)胞途徑調(diào)節(jié)離子和分子的細(xì)胞間通道，維持上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的質(zhì)膜極性。同時，緊密連接可形成機(jī)械屏障[8]，阻止溶質(zhì)和水等大分子自由通過上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞間的細(xì)胞間隙，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。依據(jù)結(jié)構(gòu)的差異，緊密連接主要分為胞漿蛋白和跨膜蛋白，其中胞漿蛋白包含 ZO（zonula occludens）蛋白家族和Cingulin。胞漿蛋白的主要作用是將跨膜蛋白與細(xì)胞骨架蛋白F－actin相連接，形成緊密連接網(wǎng)絡(luò)，在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞頂端和基底外側(cè)區(qū)域起到阻塞溶質(zhì)自由進(jìn)出的作用。跨膜蛋白包括Occludin，Claudins和Tricellulin等，其細(xì)胞外環(huán)可相互融合起到封閉細(xì)胞間隙的作用。因為2個細(xì)胞之間是直接接觸且相互融合，所以在緊密連接的水平，細(xì)胞間隙幾乎不存在[9]。因而，緊密連接是上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞維持細(xì)胞極性的重要結(jié)構(gòu)蛋白。緊密連接并不是不可滲透的結(jié)構(gòu)，經(jīng)由水性孔隙和轉(zhuǎn)運蛋白的過程，緊密連接蛋白會表現(xiàn)出對離子和分子的特異性選擇[10]。

有報道指出，細(xì)菌、病毒等可通過損壞上呼吸道黏膜緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)來改變細(xì)胞間緊密連接的通透性，降低上呼吸道黏膜屏障功能，這可能是上呼吸道感染的重要原因之一[11－12]。本研究中對緊密連接蛋白維持上呼吸道黏膜屏障完整性的作用及其與上呼吸道感染關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 胞漿蛋白

胞漿蛋白在緊密連接中主要起阻塞上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞頂端和基底外側(cè)溶質(zhì)自由進(jìn)出的作用。其中，Cingulin是一個相對分子質(zhì)量為140×103的胞漿蛋白，其N－端能與ZO－1和細(xì)胞骨架蛋白F－actin相結(jié)合，發(fā)揮銜接細(xì)胞骨架和其余胞漿蛋白的作用。而ZO蛋白家族則負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運和維持上皮細(xì)胞極性，在上呼吸道黏膜免疫中起著至關(guān)重要的作用。

ZO蛋白家族：按結(jié)構(gòu)劃分屬膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣同系物（membrane associated guanylate kinase，MAGUK），目前發(fā)現(xiàn)的主要有 ZO－1，ZO－2和 ZO－3。ZO－1是一種針對肝臟的富結(jié)點部位產(chǎn)生的單克隆抗體的抗原[13]；ZO－1免疫共沉淀的ZO－2[14]，相對分子質(zhì)量約為160×103；ZO－3是一個磷酸化異構(gòu)體[15]，相對分子質(zhì)量約為130×103。上述3個蛋白結(jié)構(gòu)中都具有1個SH3結(jié)構(gòu)域，3個PDZ結(jié)構(gòu)域和1個 GUK結(jié)構(gòu)域，從NH2端點開始按相對分子質(zhì)量由大到小依次排列（見圖1）[16]。其中，ZO－1是構(gòu)成緊密連接網(wǎng)絡(luò)的樞紐蛋白，參與調(diào)節(jié)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和維持上皮細(xì)胞極性、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和基因轉(zhuǎn)錄等多個重要過程[17]。

圖1 ZO－1，ZO－2和 ZO－3的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

ZO－1的結(jié)構(gòu)：ZO－1是 1個相對分子質(zhì)量為210～225×103的緊密連接相關(guān)蛋白[18]，其結(jié)構(gòu)中含有1個長的羧基末尾區(qū)域和富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的酸性模塊，幾個選擇性剪接點。在緊密連接網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)成中，ZO－1主要是通過與其同源體的ZO－2和ZO－3相結(jié)合[18]，為跨膜蛋白和胞漿蛋白搭建具備銜接作用的“腳手架樣平臺”。通過ZO－1的作用可使細(xì)胞骨架、信號和完整的蛋白質(zhì)連接固定在膜的特定區(qū)域，維持細(xì)胞的柵欄和屏障功能。由于ZO－1的結(jié)構(gòu)和功能與緊密連接的形成密切相關(guān)，因此當(dāng)ZO－1結(jié)構(gòu)受到破壞時，緊密連接的結(jié)構(gòu)也會隨之變化，故常以ZO－1作為評價細(xì)胞間屏障功能的主要指標(biāo)。

上呼吸道感染過程中ZO－1的變化：克雷伯桿菌感染初期可引發(fā)呼吸道上皮細(xì)胞ZO－1和Occludin蛋白表達(dá)下降[19]，感染后第 2天，大鼠細(xì)支氣管上皮ZO－1蛋白表達(dá)開始下降，細(xì)支氣管壁和肺泡隔內(nèi)可見中性粒細(xì)胞浸潤，但上皮細(xì)胞連接緊密；感染第4～16天，細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞ZO－1和Occludin蛋白表達(dá)均明顯下降，且2種蛋白降低趨勢基本相似，中性粒細(xì)胞浸潤增多，少數(shù)上皮細(xì)胞排列松散，也見上皮細(xì)胞明顯脫落。表明隨著細(xì)菌的感染，ZO－1和Occludin蛋白受到破壞，細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)也隨之改變，黏膜屏障功能受損，可能是導(dǎo)致上呼吸道感染發(fā)生并發(fā)展的重要原因。當(dāng)極化的正常人鼻上皮細(xì)胞（human nasal epithelial cells，HNECs）感染呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）后[20]，鼻病毒（rhinovirus，RV)可通過將ZO－1從細(xì)胞膜異位致細(xì)胞質(zhì)中，通過解離緊密連接來破壞氣道上皮細(xì)胞的屏障功能。

2 跨膜蛋白

2.1 Occludin蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

跨膜蛋白主要包括 Claudin蛋白家族、Occludin、Tricellulin和連接黏附分子（Junctional Adhesion Molecule，JAM）。Claudin作為緊密連接中主要的跨膜蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)27名成員。緊密連接中第1個被發(fā)現(xiàn)的整合蛋白是Occludin。而Tricellulin被認(rèn)為是細(xì)胞緊密連接的中心成分，能參與調(diào)控旁細(xì)胞途徑的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運。JAM屬Ⅰ型整合蛋白，主要功能是可選擇性地集中在不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接處，參與單核細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，Occludin蛋白、Claudin蛋白家族和JAM與上呼吸道黏膜免疫功能的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[21－23]。

Occludin的結(jié)構(gòu)與功能：Occludin是緊密連接中第1個被識別出來的整合蛋白，相對分子質(zhì)量約為60×103，其名稱來源于拉丁詞“occludere”[18]，即封閉的意思，其結(jié)構(gòu)包括2個富含酪氨酸殘基的細(xì)胞外環(huán)、3個細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)和4個跨膜結(jié)構(gòu)[18]。其中，2個細(xì)胞外環(huán)大小不等，第1個細(xì)胞外環(huán)中的1／2以上是由酪氨酸殘基和甘氨酸形成，具有維持緊密連接穩(wěn)定性及屏障功能的作用。其 C，N端伸進(jìn)胞漿內(nèi)與 ZO－1，ZO－2，ZO－3銜接并彼此互相作用后，才能使相鄰的細(xì)胞外環(huán)相互作用而形成緊密連接網(wǎng)絡(luò)。Occludin進(jìn)入緊密連接復(fù)合體后，連接部位的細(xì)胞膜通透性就會降低，僅容許小分子物質(zhì)進(jìn)出。故Occludin蛋白在緊密連接維持上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的通透性中扮演著至關(guān)重要的角色[24]。

上呼吸道感染過程中Occludin的變化：在病毒入侵過程中，Occludin可能通過增加巨噬細(xì)胞或類似胞吞的作用調(diào)節(jié)病毒的繁殖速度[21]。而在HNECs感染RSV的實驗中觀察到，Occludin，ZO－2，Cingulin等緊密連接蛋白的表達(dá)上調(diào)[25]，這可能是防止細(xì)菌及病毒感染上呼吸道的重要途徑。在RT－PCR和實時PCR中，Claudin－4和Occludin的mRNA在RSV感染24 h后增加，而在未感染的對照組和具有紫外線（UV）滅活的RSV組中未觀察到變化。Western印跡法檢測結(jié)果顯示，在RSV感染72 h后，僅Claudin－1減少，而Claudin－7，ZO－1，JAM－A和E－鈣黏蛋白無變化。結(jié)果表明，在上皮細(xì)胞感染RSV后，緊密連接蛋白在屏障功能中起關(guān)鍵作用。

2.2 Claudin蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能

Claudin的結(jié)構(gòu)：Claudin是1998年在雞肝臟中首次被發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為20×103～27×103的蛋白，名稱來源于拉丁詞“claudere”，即關(guān)閉的意思[18]。目前，已發(fā)現(xiàn)27個成員，是緊密連接中重要的跨膜蛋白家族，具有柵欄和屏障功能。Claudin蛋白的結(jié)構(gòu)主要由4個疏水的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)、大小不等的2個細(xì)胞外環(huán)和位于細(xì)胞質(zhì)中的羧基端和氨基端構(gòu)成[17]。其中，羧基上的氨基酸高度保護(hù)內(nèi)部構(gòu)成PDZ聯(lián)合基序。PDZ是1個由80～90個氨基酸組成的模塊，存在于羧基末端，與特定的位點結(jié)合。通過這些位點，Claudin可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相結(jié)合，構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)，起到柵欄和屏障功能[18]。由圖2可知，以Claudin－3為例，其N端和C端都朝向側(cè)翼細(xì)胞質(zhì)?？缂?xì)胞膜顯示，2個細(xì)胞外環(huán)（EL）結(jié)構(gòu)域，Claudin－3與 ZO －1／ZO －2的PDZ結(jié)合基序“COOH－YV”序列結(jié)合并通過支架ZO－1與細(xì)胞骨架如肌動蛋白的蛋白質(zhì)連接，而ZO－1則可通過其他PDZ－結(jié)構(gòu)基序與ZO－2相連接，構(gòu)成緊密連接網(wǎng)絡(luò)，封閉細(xì)胞間隙[26]。

圖2 細(xì)胞中Claudin－3信號的圖解

上呼吸道感染過程中Claudin的變化：產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素（CPE）可通過其N－尾端聚合形成孔隙，并通過C－尾端與緊密連接蛋白結(jié)合，破壞上皮層的屏障功能[22]，靶向的與鼻咽相關(guān)淋巴組織（nasopharynx associated lymphoid tissue，NALT)的黏膜上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白相互作用，引起細(xì)胞毒性。而Claudin－4則可通過優(yōu)先與NALT的黏膜上皮細(xì)胞作用，包括M細(xì)胞[27－29]，將抗原直接遞呈至上皮而不誘導(dǎo)細(xì)胞毒性[27－28，30]。該免疫反應(yīng)足以預(yù)防呼吸道肺炎球菌的感染，而Claudin－4在此過程中有至關(guān)重要的作用。

2.3 JAM蛋白家族的結(jié)構(gòu)與功能

JAM蛋白家族的結(jié)構(gòu)：連接黏附因子(JAM）[31]隸屬于免疫球蛋白超家族成員，最初在血小板中發(fā)現(xiàn)的是1個相對分子質(zhì)量約為40×103的單跨膜蛋白－JAM－A，是JAM蛋白家族的經(jīng)典成員。目前，已發(fā)現(xiàn)7名成員，包括 3種經(jīng)典 JAM（JAM －A，JAM －B，JAM －C）和 4種相關(guān)蛋白（JAM －4，JAM －L，CAR，ESAM）。其中，AM －A，JAM－B和JAM－C細(xì)胞質(zhì)的C－尾端所具有的Ⅱ型PDZ結(jié)合基序可與各種細(xì)胞內(nèi)支架蛋白相互作用，并形成極性復(fù)合物[31－34]。非經(jīng)典 JAM 家族（CAR，ESAM 和JAM－4）的成員含有Ⅰ型PDZ結(jié)合基序。2種基序都可結(jié)合多種細(xì)胞內(nèi)配體（AF－6，MUPP－1，ZO －1，PAR －3，MAGI－1，LNX 和 CASK），詳見圖 3。分子 JAM －L 是唯一不含有PDZ結(jié)合基序的JAM家族成員，因此被認(rèn)為不與任何PDZ蛋白結(jié)合。JAM可在黏附連接處與緊密連接蛋白形成同嗜性和異嗜性的相互作用，還可與其他JAM家族成員或整聯(lián)蛋白形成順式或反式的相互作用[8]。JAM在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)，包括上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、雄性生殖系統(tǒng)細(xì)胞、中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[35－37]，其主要作用是選擇性地集中在不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接處，調(diào)控單核細(xì)胞的遷移。研究發(fā)現(xiàn)，JAM－A對鼻黏膜屏障功能的調(diào)節(jié)具有重要作用。

圖3 JAM蛋白家族及作用

JAM－A的結(jié)構(gòu)和功能：屬于免疫球蛋白超家族中的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)主要包括2個細(xì)胞外免疫球蛋白樣的結(jié)構(gòu)域[38]。ZO－1等緊密連接支架蛋白可與JAM－A的C－尾端的PDZ結(jié)合基序相互作用，形成一個大的蛋白質(zhì)復(fù)合物[39－41]，參與到緊密連接的分子組成中，調(diào)節(jié)小溶質(zhì)物質(zhì)的進(jìn)出[37，42]。有研究提出，在慢性炎癥過程中，促炎性細(xì)胞因子（如IFN－γ和TNF－α）的釋放會導(dǎo)致JAM－A的表達(dá)降低，JAM－A依賴性信號傳導(dǎo)途徑遭到破壞可能是疾病惡化的重要原因[37，42－43]。JAM － A 還參與了調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的旁細(xì)胞通透性、細(xì)胞的增殖和遷移等重要環(huán)節(jié)[44]。

呼吸系統(tǒng)疾病中JAM－A的變化：JAM－A通常出現(xiàn)在緊密連接建立的早期，通過在上皮細(xì)胞緊密連接連接處聚集Occludin等蛋白而構(gòu)成細(xì)胞機(jī)械屏障[23]。在RSV傳染的HNECs中，蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平證實了Claudin－4和Occludin的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致緊密連接屏障功能的增強(qiáng)，而Claudin－1的減少是在RSV感染72 h后。在RSV感染24 h后的免疫細(xì)胞組化中，與對照組相比，ZO－1，JAM－A和E－鈣黏蛋白增加。這些都表明，緊密連接蛋白在維持上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞屏障性能的完整性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[25]。

3 展望

作為與外界接觸的第一道屏障，上呼吸道肩負(fù)了防止病原體入侵的重要責(zé)任，而緊密連接蛋白作為上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械屏障的重要構(gòu)成部分，阻止溶質(zhì)和水等大分子物質(zhì)自由通過上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞間隙，在保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。相鄰細(xì)胞的緊密連接跨膜蛋白（Occludin等）經(jīng)由細(xì)胞外環(huán)互相聯(lián)合，構(gòu)成“成對”的結(jié)構(gòu)，封鎖細(xì)胞間隙；ZO等則作為骨架連接跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白形成緊密連接，緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)是否完整直接決定了上皮細(xì)胞屏障功能的完整性。緊密連接受到破壞，上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，可能是上呼吸道感染發(fā)生和發(fā)展的重要原因。受涼、氣候突變、淋雨、過度疲勞等外界因素都會加快本來已經(jīng)存在于上呼吸道或從外界入侵上呼吸道的病毒或細(xì)菌的繁殖速度，造成患者全身或上呼吸道局部防御功能降低，進(jìn)而誘發(fā)上呼吸道感染[45]。上述因素是否可導(dǎo)致緊密連接的破壞，尚缺乏強(qiáng)有力的證據(jù)支持。維持上呼吸道緊密連接的完整性，對于防治上呼吸道感染具有重要意義。但目前對緊密連接蛋白的研究大部分都集中于下呼吸道肺泡上皮細(xì)胞，對緊密連接蛋白在上呼吸道黏膜免疫中的作用機(jī)制尚不明確，值得進(jìn)一步系統(tǒng)地深入研究。