李春燕，蘭景超，羅 娌，黃文俊，張浩杰，董曉薇，古小彬，謝 躍，楊光友*

(1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院/ 動物寄生蟲病研究中心，四川成都611130；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川成都610081)

犬惡絲蟲病(Dirofilariasis)是一種以犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)為病原，蚊為中間宿主的，主要危害犬科、貓科動物的人畜共患寄生蟲病，在亞洲、非洲、大洋洲、歐洲南部和美洲等蚊蟲聚集地廣泛分布，引起一系列的公共安全問題[1]。蟲體主要寄生于動物的右心室及肺動脈，有時也可見于動物的胸腔和支氣管。動物患病早期可能不表現明顯的臨床反應或僅表現皮膚瘙癢等皮炎癥狀，患病后期根據蟲體寄生部位和寄生數量的不同也可能表現出不同的臨床癥狀。犬惡絲蟲少量寄生時，動物常呈隱性感染，癥狀不明顯；當寄生于心臟和肺臟的蟲體數量較大時動物可能表現出身體消瘦、皮膚黃染、少動、咳嗽，劇烈運動中突然出現呼吸困難，猝死等癥狀。人也可以被含有感染期幼蟲(L3)的蚊叮咬感染該病，主要侵害人的肺臟，引起咳嗽、胸悶和胸疼等癥狀，有時也可寄生于人的皮下、眼部和陰囊[2]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，主要通過滅活或抑制同源的絲氨酸蛋白酶活性來調節(jié)蛋白酶介導的活動，參與多種生理活動，如血液凝固、補體激活和腫瘤抑制等。此外，Serpin 也是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠介導宿主20 多種抗炎作用，起到增強或抑制免疫的作用[3]?，F已證實Serpin 蛋白在線蟲病和吸蟲病中具有一定的診斷價值[4]。

目前，犬惡絲蟲病的診斷主要包括常規(guī)診斷方法(直接血涂片檢查法、改良柯氏法等)、免疫學診斷方法(間接ELISA 檢測循環(huán)抗原、免疫層析等)和分子生物學診斷方法(PCR 鑒定)，但由于蟲體“隱性感染”的存在，這些方法均存在一定的缺陷，敏感性不高[5]。本實驗首次擴增犬惡絲蟲的Di-Serpin基因片段，原核表達并純化重組蛋白rDi-Serpin，通過western blot 和間接免疫熒光(IFA)定位探究其生物學特性，并初步評價了rDi-Serpin 的診斷價值，為犬惡絲蟲病早期診斷方法的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、載體及實驗動物 犬惡絲蟲蟲體采自四川省自然感染并剖檢的犬，蟲體自犬心臟分離后使用PBS 清洗，參照有關文獻資料，經形態(tài)學鑒定為犬惡絲蟲。大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pET-32a(+)載體和pMD19-T 載體購自天根生化科技(北京)有限公司；犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白由四川農業(yè)大學動物寄生蟲病研究中心提供。2只3 月齡～4 月齡雌性健康新西蘭兔，體質量1.5 kg～2.0 kg，購自成都達碩生物有限公司。

1.2 血 清 20 份犬惡絲蟲陽性血清采自四川省自然感染的犬(經剖檢在心臟內查到犬惡絲蟲蟲體)；24 份犬惡絲蟲陰性血清采自春季，經體內外驅蟲處理后糞檢鑒定無寄生蟲感染的3 月齡犬。8 份人工感染豆狀帶絳蟲(Taenia pisiformis)的犬血清樣品、9份人工感染多頭帶絳蟲(Taenia multiceps)的犬血清樣品、9 份自然感染犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)的犬血清樣品、19 份自然感染犬弓首蛔蟲(Toxocara canis)的犬血清樣品和5 份自然感染等孢球蟲(Isosporasp.)的犬血清樣品均由四川農業(yè)大學動物寄生蟲病研究中心提供。以上血清樣本均經糞檢和死亡剖檢確認，為單一蟲種感染。兔陰性血清采自四川省某兔場1 月齡～2 月齡的仔兔。

1.3 主要試劑 總RNA 抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒和HRP-DAB 底物顯色試劑盒、TMB 底物顯色液均購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性內切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)、T4 DNA 連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗兔HRP-IgG、兔抗犬HRP-IgG、羊抗兔FITC-IgG 購自武漢博士德生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒、Ni2+螯合親和層析柱、HiTrap Protein A 預裝柱均購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 犬惡絲蟲Di-Serpin 基因的克隆、表達與純化從液氮中取出犬惡絲蟲蟲體，研究后根據總RNA抽提試劑盒說明提取犬惡絲蟲的總RNA，按逆轉錄試劑盒說明獲得合成cDNA。參照犬惡絲蟲成蟲轉錄組數據庫中的Serpin 基因序列unigene 979，切除信號肽后利用軟件Primer premier 6.0 設計引物(上游： 5'-CGCGGATCCAAAGTTGTAAAATTACCCTA-3'，含BamHⅠ酶切位點；下游：5'-CCGGAATTCTTAGATTCTCCAAATAAACTGCGG-3'，含EcoRⅠ酶切位點)。以制備的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min、50.4 ℃45 s、72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min；8 ℃儲存。PCR 擴增完成后，構建pET-32a(+)-Serpin 重組表達質粒，將該重組質粒轉入表達菌BL21 中，經菌液PCR 鑒定后測序。引物合成及目的基因測序均由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成。擴大培養(yǎng)測序正確的pET-32a(+)-Serpin 表達菌，在優(yōu)化的最佳誘導條件(IPTG 誘導濃度、誘導溫度、誘導時間)下大量表達，使用Ni2+螯合親和層析柱純化表達產物，得到純化后的重組蛋白rDi-Serpin，使用SDS-PAGE 對純化后的rDi-Serpin 進行檢測。

1.5 Di-Serpin 基因的生物信息學分析 根據擴增得到的犬惡絲蟲Di-Serpin 基因序列，利用在線軟件Translate(https://web.expasy.org/translate/)推測其氨基酸序列；軟件Yaspin(http://www.ibi.vu.nl/programs/yaspinwww/)預測Di-Serpin 蛋白的二級結構。采用軟件Clustal W 比對Di-Serpin 蛋白的同源序列后利用DNAMAN 軟件進行序列相似性分析、 MEGA 6.0軟件構建系統(tǒng)進化樹(Maximum Likelihood 法)。

1.6 兔抗rDi-Serpin-IgG 血清的制備與純化 將純化后的rDi-Serpin 與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按1∶1 比例混合制成油包水的乳制劑，蛋白濃度約為1 mg/mL。分別對兩只新西蘭兔皮下多點注射，蛋白量為200 μg/只，每次間隔2 周，共免疫4次。以兔免疫前血清為陰性對照，PBS 為空白對照，測得兔多抗血清效價大于1∶1 200 后對其心臟采血并分離血清。獲得的兔多抗血清經飽和硫酸銨粗提純，0.45 μm NC 膜過濾，HiTrap Protein A 預裝柱純化得到兔抗rDi-Serpin-IgG，使用SDS-PAGE 對純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 進行檢測。參照上述方法純化得到兔陰性血清IgG。

1.7 Western blot 分析 純化后的rDi-Serpin 和犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白經SDS-PAGE 分離后電轉至硝酸纖維素濾膜(NC 膜)上，5 %脫脂奶粉室溫封閉2 h 后分別利用犬的犬惡絲蟲陽性血清和陰性血清(1∶100 稀釋)、兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG(1 ∶200 稀釋)作為一抗孵育rDi-Serpin，利用兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG (1∶200 稀釋)作為一抗孵育犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白。充分洗滌后分別加入兔抗犬HRP-IgG 和羊抗兔HRP-IgG (1∶2 000 稀釋)作為二抗，western blot 檢測rDi-Serpin 與rDi-Serpin-IgG 的反應原性。

1.8 犬惡絲蟲蟲體橫切面Serpin 蛋白的IFA 定位將4 %多聚甲醛固定的犬惡絲蟲雌性和雄性成蟲經石蠟包埋、切片處理(4 μm/片)、光學顯微鏡下觀察篩選得到結構完整的切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸緩沖液熱修復、3 % H2O2氧化修復后滴加5 %牛白蛋白溶液(BSA)室溫封閉1 h，分別滴加兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG (1∶100 稀釋)作為一抗，羊抗兔FITC-IgG (0.1 %伊文氏藍1∶100 稀釋)作為二抗，4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)染色劑對蟲體細胞核顯色，甘油緩沖液封片后熒光顯微鏡下觀察Serpin 蛋白在犬惡絲蟲蟲體橫切面上的分布并拍照記錄。

1.9 間接ELISA 方法的建立 以純化后的rDi-Serpin 為包被抗原，采用棋盤滴定法，對包被抗原濃度(3.75 μg/ 孔、1.87 μg/ 孔、0.94 μg/ 孔、0.47 μg/孔、0.23 μg/ 孔和0.12 μg/ 孔)、血清的稀釋度(1∶20、1 ∶40、1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320、1 ∶640、1 ∶1 280 和1∶2 560)、封閉液(1 % BSA、5 % 脫脂奶粉和10%脫脂奶粉)、二抗的稀釋度(1 ∶1 000、1 ∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000)進行優(yōu)化。使用優(yōu)化后的最佳包被抗原濃度4 ℃孵育過夜，封閉液封閉，以犬惡絲蟲陽性血清和陰性血清作為一抗，兔抗犬HRP-IgG 作為二抗，TMB 底物顯色液顯色，2 mol/L 的H2SO4終止后，酶標儀測定其OD450nm值。

陰陽性判斷標準采用Cut off 值法，即采用優(yōu)化后的反應條件分別對24 份犬的犬惡絲蟲陰性血清的OD450nm值進行測定，計算算數平均值(X)和標準方差(SD)后根據公式臨界值=X+3SD 得到Cut off 值，當檢測樣本OD450nm值大于且等于Cut off 值則判定為陽性。

利用優(yōu)化后的間接ELISA 方法對犬的20 份犬惡絲蟲陽性血清和24 份犬惡絲蟲陰性血清進行檢測判定該方法的敏感性；同時，對犬的8 份豆狀帶絳蟲陽性血清、9 份多頭帶絳蟲陽性血清、9 份犬鉤口線蟲陽性血清、19 份犬弓首蛔蟲陽性血清和5 份球蟲陽性血清進行檢測，判定該方法的特異性；將犬惡絲蟲陽性血清按1∶10～1∶12 800 做2 倍系列稀釋，判定血清最大稀釋倍數，確定該方法的靈敏度。根據公式敏感性=100 %×真陽性血清數/(真陽性血清數+假陰性血清數)，特異性=100 %×真陰性血清數/(真陰性血清數+ 假陽性血清數)確定該方法的敏感性和特異性。每次每板均設置陰、陽性血清對照和空白對照，以空白調零，通過批內和批間重復性試驗的變異系數(CV= 標準方差/ 平均值)來檢測該方法的重復性。

1.10 Di-Serpin 診斷價值的初步評價 使用建立間接ELISA 方法對經傳統(tǒng)方法- 飽和食鹽水漂浮法和貝爾曼法檢測犬糞便內寄生蟲種類后剖檢犬心臟及腸道進行寄生蟲檢查，確定的24 份無寄生蟲病感染的犬血清、20 份僅感染犬惡絲蟲病的陽性血清和50 份僅感染除犬惡絲蟲病的其它寄生蟲病的犬血清進行檢測，比較該方法與傳統(tǒng)方法的差異，按公式總體符合率=100 %×(真陽性血清數+ 真陰性血清數)/(真陽性血清數+ 假陽性血清數+ 真陰性血清數+假陰性血清數)計算。

2 結 果

2.1 Di-Serpin 基因的克隆、表達與純化 PCR 擴增結果顯示，擴增產物大小與預期的Di-Serpin 相符(圖1)，測序結果顯示Di-Serpin 基因片段長363 bp，表明克隆結果即所求片段。擴大培養(yǎng)測序正確的pET-32a(+)-Serpin/BL21 表達菌，37 ℃，經0.8 mmol/L IPTG 誘導12 h 后檢測，結果顯示，rDi-Serpin 正確表達(圖2 泳道2)，且該蛋白主要以包涵體的形式存在，大小約為32 ku (Di-Serpin 蛋白約14 ku，His標簽約18 ku)。經Ni2+螯合親和層析柱純化后，得到的rDi-Serpin 條帶較單一，表明該蛋白純度較好(圖2 泳道3)，具備進一步研究的潛力。

圖1 Di-Serpin 基因的PCR 擴增Fig.1 Amplification of Di-Serpin gene by RT-PCR

2.2 Di-Serpin 基因的生物信息學分析 分析結果顯示擴增的基因片段共編碼121 個氨基酸，預測蛋白質分子量為13.56 ku，等電點為5.06，含有1 個Serine protease inhibitor 結構域，2 個糖基化位點和2個豆蔻?；稽c，表明Di-Serpin 是Serpin 超家族中的一員?；谲浖﨑NAMAN 對不同來源的Serpin氨基酸序列進行相似性分析，結果顯示犬惡絲蟲的Di-Serpin 與羅阿絲蟲(Loa loa)Serpin 氨基酸的序列相似性最高(78 %)，與旋毛蟲(Trichinella spiralis)和豬帶絳蟲(Taenia solium)的Serpin 氨基酸序列相似性較低(51 %和37 %)。系統(tǒng)進化樹顯示，犬惡絲蟲與羅阿絲蟲親緣關系較近，先與之聚類后再依次與馬來絲蟲(Brugia malayi)、班氏絲蟲(Wuchereria bancrofti)聚類，與旋毛蟲、豬帶絳蟲等親緣關系較遠(圖3)，表明Di-Serpin 基因的系統(tǒng)進化關系與該蟲的進化關系一致。

圖2 基于rDi-Serpin 的SDS-PAGE 檢測與western blot 分析Fig.2 The SDS-PAGE detection and western blot analysis of rDi-Serpin

圖3 Di-Serpin 的系統(tǒng)進化樹(ML 樹)Fig.3 The phylogenetic tree based on Di-Serpin gene(Maximum Likelihood tree)

2.3 兔抗rDi-Serpin-IgG 的制備與western blot 分析 純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 在約50 ku 和25 ku分別出現抗體的重鏈和輕鏈，且50 ku 條帶較清楚(圖2 泳道4)，表明純化后的rDi-Serpin-IgG 結構完整且純度較好。Western blot 結果顯示，純化后的rDi-Serpin 能夠被自然感染犬惡絲蟲的犬陽性血清與純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 識別，不能被犬陰性血清和兔陰性血清IgG 識別(圖2 泳道5～8)，表明rDi-Serpin 具有較好的反應原性。純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 能夠與犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白反應，在約23 ku 位置能檢測到蛋白信號，大小與預測的Serpin 天然蛋白大小基本一致(圖2 泳道9)，表明rDi-Serpin 即犬惡絲蟲的Serpin 蛋白。

2.4 Di-Serpin 蛋白的IFA 定位 IFA 檢測Serpin蛋白在犬惡絲蟲蟲體模切面上的分布，結果顯示，Di-Serpin 在雌性和雄性成蟲的表皮層、肌肉層、腸上皮、子宮、睪丸中均有表達，其中在表皮層和腸上皮表達水平較高，在蟲體的肌肉層、雄蟲睪丸的表面和雌蟲子宮表達量較低(圖4)，提示Di-Serpin可能是一種分泌性的蛋白。

圖4 雄性、雌性犬惡絲蟲橫切面Di-Serpin 蛋白的IFA 定位Fig.4 Tissue localization of the transverse sections of male and female D.immitis Di-Serpin protein detected by indirect immunofluorescence

2.5 間接ELISA 方法的建立 采用棋盤滴定法優(yōu)化結果顯示，rDi-Serpin 蛋白最佳包被濃度為0.47 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶160，最佳封閉液為5 %脫脂奶粉，二抗的最佳稀釋度為1∶3 000。利用優(yōu)化后的反應條件測定24 份犬的犬惡絲蟲陰性血清OD450nm值，結果顯示，OD450nm值的算數平均值為0.241，標準差為0.029，根據公式計算得到Cut off值為0.328，即當OD450nm≥0.328 時，可判定為陽性，當OD450nm＜0.328 可判定為陰性。

2.6 敏感性和特異性分析 利用建立的間接ELISA方法檢測20 份犬的犬惡絲蟲陽性血清和24 份陰性血清，結果顯示14 份陽性血清OD450nm＞0.328，6 份陽性血清和24 份陰性血清OD450nm＜0.328 (圖5A)，該方法的敏感性為70 % (14/20)，使用該方法進行檢測可能出現假陰性結果。利用建立的間接ELISA方法檢測豆狀帶絳蟲陽性血清、多頭帶絳蟲陽性血清、犬鉤口線蟲陽性血清、犬弓首蛔蟲陽性血清和球蟲陽性血清，對其它寄生蟲陽性血清結果顯示包被的rDi-Serpin 除與豆狀帶絳蟲陽性血清交叉反應較強外，與其它蟲種的陽性血清也存在部分交叉反應(圖5B)，該方法的特異性為70 % (35/50)，使用該方法進行檢測可能出現假陽性結果。

圖5 重組蛋白rDi-Serpin 的間接ELISA 檢測犬惡絲蟲Fig.5 Indirect ELISA for the detection of the D.immitis in dog by using rDi-Serpin

2.7 靈敏度試驗 利用間接ELISA 方法檢測經1:10～1∶12 800 倍比稀釋后的犬惡絲蟲陽性血清，結果顯示，當陽性血清1∶1 600 稀釋時OD450nm＞0.328，當1∶3 200 稀釋時OD450nm＜0.328，因此該方法的靈敏度為1∶1 600，陽性血清稀釋1 600 倍后仍能被檢出。

2.8 重復性試驗 利用間接ELISA 方法進行批內和批間重復性試驗，結果顯示，批內重復性試驗變異系數小于5%；批間重復性試驗變異系數小于10%(表1)，表明該檢測方法重復性較好。

表1 間接ELISA 重復性試驗(n=6)Table 1 Repeatability assay of the indirect ELISA (n=6)

2.9 符合率試驗 20 份犬惡絲蟲陽性血清、24 份犬惡絲蟲陰性血清和50 份其它蟲種陽性血清均是經過傳統(tǒng)方法確認無誤后使用。間接ELISA 檢測結果表明，該方法對無寄生蟲感染的犬檢測正確率為100 %，但對僅感染犬惡絲蟲和僅感染其它寄生蟲的犬檢測正確率均為70 %，陰性符合率為79.7 %(59/74)，總體符合率為77.7 % (73/94)，表明該方法的正確率不高。

3 討 論

犬惡絲蟲“隱性”感染的存在，即犬惡絲蟲感染早期宿主血液中幼蟲尚未發(fā)育成熟，或宿主體內僅存在雄蟲，或宿主體內發(fā)育成熟的雌蟲未產生循環(huán)微絲蚴，嚴重影響著犬惡絲蟲病診斷的準確性，常規(guī)的診斷方法常出現假陰性的結果[2,5-6]，市場上現有的犬惡絲蟲病商品化檢測試劑盒對宿主體內僅感染雄蟲或感染早期也無法準確檢測[7-8]。由于宿主體內犬惡絲蟲抗體比循環(huán)抗原能更早地被檢出，抗體檢測或許可以用于犬惡絲蟲病的早期診斷[9]。研究表明，使用純化后的犬惡絲蟲粗抗原檢測該病敏感性(91.7 %)和特異性均較高，但該方法存在蟲體粗抗原來源受限和蟲體各時期粗抗原的差異性較大的缺點[10-11]。蟲體的重組抗原由于具有穩(wěn)定的來源和較好的敏感性及特異性，現已成為該病診斷研究的方向之一，犬惡絲蟲轉錄組數據和分泌組數據的相繼公開，也為該病候選診斷抗原的篩選創(chuàng)造了可能。近期，有研究表明以犬惡絲蟲的重組蛋白二?；视图っ?DgK)作為抗原診斷該病，敏感性和特異性分別為92.5 %和87.5 %[12]。

Serpin 廣泛存在于寄生蟲中，是寄生蟲與宿主間發(fā)生相互作用的重要分子，可作用于宿主酶有利于蟲體從宿主獲取營養(yǎng)，或抵抗宿主酶對蟲體的損傷，或調節(jié)宿主的炎癥及免疫應答[4]。本研究首次對雌性和雄性犬惡絲蟲橫切面上Di-Serpin 蛋白的分布進行研究，結果顯示Di-Serpin 的分布情況與旋盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)、華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)和多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)等蟲體上Serpin 的分布規(guī)律相似，主要分布于蟲體體表和腸上皮[13-15]。這提示Di-Serpin 可能是一種分泌性的蛋白，能夠分泌到蟲體外與宿主中的蛋白酶反應，有利于幼蟲在宿主體內的移行和長期寄生，本研究結果為進一步探究其功能奠定了基礎。

寄生蟲的Serpin 具有良好的免疫反應性，可以作為寄生蟲早期血清學診斷的候選抗原，現有研究已證實該蛋白在馬來絲蟲、旋毛蟲和旋盤尾絲蟲上具有較好的診斷價值[4]。本研究首次使用western blot 對rDi-Serpin 的免疫原性進行了研究，發(fā)現該蛋白具有較好的免疫反應性，可能具備犬惡絲蟲早期診斷候選抗原的潛力。雖然基于rDi-Serpin 建立的間接ELISA 方法靈敏度高達1∶1 600，對無寄生蟲感染的犬血清樣品進行檢測正確率達100 %，但對僅感染犬惡絲蟲病和僅感染其它寄生蟲的犬血清樣品進行檢測正確率不高，敏感性和特異性均為70 %，既存在假陰性結果，也存在假陽性結果。分析間接ELISA 方法敏感性較低的原因，一是本次擴增的Di-Serpin 基因是犬惡絲蟲Di-Serpin 蛋白的一個片段[16]，可能未包含全部抗原決定簇，犬血清中針對該抗原決定簇的抗體含量較低；二是可能與犬血清中抗原-抗體復合物的存在有關，有研究表明血清中抗原-抗體復合物的存在會干擾抗原的檢測[17-18]。本研究結果顯示，該蛋白或許并不適合作為犬惡絲蟲病的候選診斷抗原。