韋艷娜，張珍珍，王 麗，王 佳，陳 蓉，馮志新，邵國青，熊祺琰

(江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所農業(yè)部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇南京210014)

豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎(俗稱豬氣喘病)的病原體，該病呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失[1]。國內外大多采用疫苗防控該疾病，豬支原體肺炎168 株活疫苗由江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)所研制，保護效率高于滅活疫苗，得到市場好評。目前國內市場上豬支原體肺炎活疫苗的免疫途徑主要是胸腔注射(豬支原體肺炎Z 株活疫苗)或肺內注射(豬支原體肺炎168 株活疫苗)、滴鼻免疫(豬支原體肺炎RM48株活疫苗)，對于豬支原體肺炎168 株活疫苗而言肺內注射的免疫途徑給豬場實際使用造成一定的不便，滴鼻、氣霧免疫等黏膜免疫途徑具有操作便利、動物應激小等優(yōu)勢，因此該免疫途徑成為進一步研究該疫苗免疫效力的主要方向。

佐劑可提高疫苗免疫效果，為增加經滴鼻免疫途徑的豬支原體肺炎168 株活疫苗的免疫效果，本研究擬開發(fā)一種適合于Mhp 活疫苗使用的黏膜佐劑。目前研究較多的黏膜佐劑包括殼聚糖、細菌毒素、CpG、PolyI:C、納米乳等[2-3]?；魜y毒素B 亞單位(Cholera toxin subunit B，CTB)是霍亂腸毒素的無毒亞基，能夠與大多數(shù)哺乳動物細胞表面的神經節(jié)苷脂(Monosialoganglioside，GM1)特異性結合，可使與其連接的抗原蛋白更易與黏膜作用，進而引起免疫機體一系列生理生化反應，使其產生更強的免疫效果[4]。Hou 等將CTB 作為黏膜佐劑與HIV-1 DNA疫苗聯(lián)合后免疫小鼠可誘導其產生高水平的Th1 和Th2 型細胞因子、炎癥細胞因子和趨化因子，同時提高血清中Env 蛋白的IgG 抗體水平[5]；Miyata 等將CTB 與蛋白MSP1-19 耦合可增強小鼠對瘧原蟲的抗感染作用，通過滴鼻和皮下注射，均可提高血清和支氣管肺泡灌洗液中的IgG 抗體水平[6]?？梢奀TB 作為一種良好的黏膜免疫佐劑和抗原遞送載體，可以用于增強疫苗的免疫效果。

P97 蛋白是目前研究最為深入的Mhp 表面黏附因子，其中的P97R1 (R1 區(qū))是直接參與Mhp 黏附細胞的區(qū)域，也是其主要的抗原決定簇[7-8]，為少數(shù)被證明具備免疫保護能力的抗原之一[9-10]?；诖耍狙芯吭O計并表達了rCTB-P97R1 重組蛋白，將其與豬支原體肺炎活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠，以評價其對該活疫苗黏膜免疫效果的增強作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物 豬支原體肺炎(168株)活疫苗，批號20170518，由本實驗室制備；含CTB 基因的重組質粒pET-CTB-p277 由中國藥科大學微基因藥物實驗室惠贈[11]；BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司；P97R1單克隆抗體(MAb)2A10 由本實驗室制備并保存[12]。40 只雌性BALB/c 小鼠，體質量18 g～22 g，購自揚州大學醫(yī)學比較中心。

1.2 主要試劑 質?？焖傩×砍樘嵩噭┖匈徸员本┤浇鹕锛夹g有限公司；DNA 回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗兔HRP-IgG 購自武漢博士德生物公司；兔源抗CTB 抗體購自美國Bio-Rad 公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Biosharp 生物科技有限公司；商品化CTB 購自Sigma 公司；GM1 購自百靈威科技有限公司；TMB 顯色液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；山羊抗鼠HRP-IgG 購自武漢博士德生物工程有限公司；低分子蛋白Marker 購自Promega公司；His-Tag 親合層析柱購自金斯瑞生物技術有限公司。

1.3 重組質粒pET-CTB-P97R1 的構建與鑒定根據(jù)GenBank 中Mhp P97 基因序列(U50901)設計引物擴增P97 基因R1 區(qū)，上下游引物P97R1-up：5'-A AAGCTAGCTTACCTCAGCCGCCAGCA-3' (NheⅠ)/P97R1-down： 5'-TTTCTCGAGAGCCATTGGGAAAT AGTCTT-3' (XhoⅠ)。以Mhp 168 株DNA 為模板，PCR 擴增P97 基因R1 重復區(qū)。PCR 反應條件：94 ℃10 min ；94 ℃60 s、54 ℃60 s、72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產物回收純化后，用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后克隆至pET-CTB-p277 載體，構建重組質粒pET-CTB-P97R1。PCR 檢測后由金斯瑞生物技術有限公司測序鑒定。

1.4 重組蛋白(rCTB-P97R1)的表達、純化及鑒定將pET-CTB-P97R1 轉化大腸桿菌BL21，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/L，37℃振蕩培養(yǎng)4 h～6 h，離心收集菌體， 超聲裂解后收集沉淀和上清， 利用SDS-PAGE 分析重組蛋白表達，同時對重組蛋白經親和層析純化，用15 % SDS-PAGE 分析純度。以P97R1 MAb 2A10 為一抗(1 ∶2 000 倍)，山羊抗鼠HRP-IgG 為二抗(1∶10 000 倍)，western blot 鑒定重組蛋白。

1.5 rCTB-P97R1 與GM1 結合能力的檢測 參照文獻[13]GM1-ELISA 方法，用GM1 (5 μg/mL)包被過夜后與不同濃度的CTB-P97R1 (從5 μg/mL 開始，2 倍倍比稀釋，直至CTB-P97R1 濃度為0.005 μg/mL)孵育，以兔抗CTB 抗體(1∶4 000 倍)為一抗，山羊抗兔HRP-IgG (1∶8 000 倍)為二抗，檢測CTB-P97R1 與GM1 的結合能力，同時使用相同濃度的商品化CTB蛋白作為對照進行對比試驗。同時將各重組蛋白與商品化CTB 蛋白均于100 ℃水浴處理5 min 后檢測其與GM1 的結合能力。

1.6 動物分組及免疫 選取BALB/c 小鼠隨機分成4 組，每組10 只，分別設為rCTB-P97R1+豬支原體肺炎(168 株)活疫苗免疫組(免疫0.3 mg rCTB-P97R1+107CCU 活疫苗)，rCTB-P97R1 對照組(免疫0.3 mg rCTB-P97R1)，豬支原體肺炎(168 株)活疫苗對照組(免疫107CCU 活疫苗)和陰性對照組，每只小鼠滴鼻免疫50 μL，2 周后以相同方式加強免疫1 次。

1.7 小鼠IgG 抗體及sIgA 抗體的檢測 在二次免疫后7 d、14 d、21 d 和28 d 分別對小鼠進行眼框采血，分離血清，-20 ℃保存，用于檢測血清中Mhp、P97R1 的IgG 抗體水平[12,14]；在二次免疫后7 d迫殺小鼠，氣管插管注入1 mL PBS，輕輕揉捏胸腔后回抽液體，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，-20 ℃保存，用于檢測BALF 中Mhp、P97R1 的sIgA 抗體水平[15]。

1.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS 軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結 果

2.1 pET28a-CTB-P97R1 的構建與鑒定 以Mhp 168 株DNA 為模板，P97R1-up/P97R1-down 為引物，PCR 擴增其P97 基因的R1 區(qū)片段P97R1，將該基因片段克隆至pET-CTB-p277 中，構建重組質粒pET- CTB-P97R1。對構建的pET-CTB-P97R1 進行PCR 鑒定，結果顯示PCR 擴增出約300 bp 的基因片段，與預期一致(圖1)。重組質粒序列測定結果顯示，其基因序列與設計的CTB-P97R1 基因片段完全一致，表明正確構建了重組質粒pET-CTB-P97R1。

圖1 重組質粒pET-CTB-P97R1 的PCR 鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET-CTB-P97R1 by PCR

2.2 rCTB-P97R1 的表達及純化 pET-CTB-P97R1/BL21 重組菌液經IPTG 誘導表達，SDS-PAGE 檢測結果顯示在21.5 ku 處出現(xiàn)目的蛋白條帶(圖2)，且rCTB-P97R1 存在于裂解上清中，用His-Tag 親合層析柱純化重組蛋白，經western blot 鑒定結果顯示，在21.5 ku 處出現(xiàn)目的條帶，與SDS-PAGE 中純化蛋白的位置一致，表明rCTB-P97R1 得到了表達，且具有較好的反應原性。

2.3 rCTB-P97R1 與GM1 結合能力的測定 通過GM1-ELISA 方法檢測rCTB-P97R1 與GM1 的結合能力。結果顯示，rCTB-P97R1 可以與GM1 結合，且隨著rCTB-P97R1 濃度的降低，其與GM1 結合能力下降，具有劑量依賴性。而不同濃度的rCTB-P97R1經過加熱處理后，其與GM1 結合能力均喪失。商品化CTB 與GM1 的結合能力也隨濃度降低而下降，且熱處理后不同濃度的CTB 與GM1 結合能力也均喪失。本實驗制備的rCTB-P97R1 的GM1 結合能力與商品化CTB 結合GM1 的能力相當(圖3)。表明rCTB-P97R1 較好地保持了天然CTB 的體外生物活性。

圖2 rCTB-P97R1 重組蛋白的表達純化和western blot 鑒定Fig.2 The detection of the rCTB-P97R1 expression, purification by SDS-PAGE and identification of the rCTB-P97R1 by western blot

圖3 rCTB-P97R1 與GM1 結合能力的檢測Fig.3 GM1-binding ability of rCTB-P97R1

2.4 免疫后小鼠血清IgG 抗體水平的檢測 于二次免疫后7 d、14 d 、21 d、28 d 采血分離血清進行抗體檢測。結果顯示陰性對照組和rCTB-P97R1 免疫組小鼠均不能產生Mhp 全菌蛋白抗體?；钜呙鐚φ战M能夠產生較強的Mhp 全菌蛋白抗體，而rCTB-P97R1+ 活疫苗免疫組小鼠該抗體水平更高，在二次免疫后7 d、14 d 、21 d 與活疫苗對照組相比差異極顯著(p＜0.01)，在二次免疫后28 d 差異顯著(p＜0.05)(圖4A)。表明rCTB-P97R1 對豬支原體肺炎活疫苗的免疫刺激能力有顯著的增強作用。

通過檢測小鼠血清中的P97R1 抗體水平結果顯示，活疫苗對照組不能有效誘導小鼠產生針對P97R1 抗原的抗體，與陰性對照組無差異。rCTBP97R1+ 活疫苗免疫組和rCTB-P97R1 組均能夠誘導小鼠產生較強的P97R1 抗體，且該兩組誘導小鼠產生的P97R1 抗體水平無顯著差異(p＞0.05)，但其與活疫苗對照組相比均差異極顯著(p＜0.01)(圖4B)，結果表明rCTB-P97R1 能夠誘導小鼠對P97R1 抗原的體液免疫應答。

圖4 免疫小鼠血清中IgG 抗體檢測Fig.4 Detection of IgG antibody in mice serum after immunization

2.5 免疫后小鼠BALF 中sIgA 抗體水平的檢測通過檢測二次免疫后7 d 的BALF 中sIgA 抗體，結果顯示rCTB-P97R1+活疫苗免疫組誘導小鼠產生抗Mhp 全菌蛋白的sIgA 抗體，與活疫苗對照組相比差異顯著(p＜0.05)，但其針對P97R1 的sIgA 抗體與其它組相比升高不顯著(p＞0.05)(圖5)。表明重組蛋白rCTB-P97R1 與活疫苗聯(lián)合使用能夠顯著增強小鼠針對全菌蛋白抗原的黏膜免疫反應。

圖5 小鼠免疫7 d 后BALF 中sIgA 抗體檢測Fig.5 Detection of sIgA antibody in BALF of the mice 7 days after second immunization

3 討 論

黏膜是機體免疫防御的第一道防線，在防御細菌、病毒等病原體引起的呼吸道及腸道感染中起主要作用。黏膜免疫與自然感染最接近，是呼吸道疾病免疫預防的理想途徑。但由于黏膜表面特殊的理化性質，減弱了黏膜免疫應答的強度，甚至常常導致免疫耐受。良好的黏膜免疫佐劑能夠幫助疫苗提高黏膜免疫能力，使少量的抗原即可誘導機體產生早期、高效且持久的免疫應答。CTB 是較為常用的黏膜免疫佐劑之一，其具有很強的增強黏膜局部及系統(tǒng)免疫應答的能力且去除了A 亞基保證了良好的安全性[4]。CTB 在黏膜免疫中的機制主要包括促進抗原通過黏膜屏障，加強抗原被樹突狀細胞(DC)和其它抗原提呈細胞(APC)的提呈作用，增強抑制性T 細胞分泌TGF-β1[16]。CTB 可以與抗原偶聯(lián)、融合或直接與抗原混合，有效發(fā)揮佐劑作用[17-18]。

Mhp 致病的先決條件是其對豬呼吸道支氣管上皮細胞的特異性黏附，因此有效誘導對重要黏附因子的免疫應答具有重要意義。P97 蛋白是參與Mhp黏附豬支氣管上皮細胞的主要因子。研究表明，P97 蛋白的主要功能域位于C 端，其中R1 區(qū)是直接參與黏附的區(qū)域，也是主要的抗原決定簇。已有多個研究室以P97 或其R1 重復區(qū)為抗原嘗試重組疫苗的研究[19-20]。

本研究采用基因工程技術將CTB 與P97R1 區(qū)基因串聯(lián)經誘導表達了重組融合蛋白rCTB-P97R1，經GM1-ELISA 方法檢測，顯示rCTB-P97R1 與GM1 的結合能力與商品化的CTB 相當，表明偶聯(lián)于C 端的P97R1 分子并未影響CTB 的構象，重組蛋白很好地保持了天然CTB 分子的佐劑活性。將CTB-P97R1與Mhp 168 活疫苗混合滴鼻免疫后，顯著提高了小鼠血清中的全菌蛋白IgG 抗體水平及BALF 中的sIgA 抗體水平，表明rCTB- P97R1 很好地發(fā)揮了黏膜佐劑作用，顯著提升了小鼠呼吸道局部粘膜免疫應答。同時，血清中針對Mhp P97R1 的IgG 抗體也顯著升高，表明rCTB- P97R1 蛋白還可以強化對Mhp 重要抗原P97R1 的免疫應答水平，更有利于對疾病的防御。

值得注意的是BALF 中針對P97R1 的sIgA 抗體并不明顯，可能與P97R1 劑量低有一定關系，提示單獨使用rCTB-P97R1 作為重組疫苗滴鼻免疫小鼠其免疫效果可能較有限，不一定能夠產生有效免疫保護。目前對Mhp 的重組疫苗也有報道，但能夠提供有效保護的重組疫苗并不多。與病毒不同，細菌的抗原成分非常復雜，對于細菌性疫苗而言重組疫苗的研制更加困難，僅依靠一種或少數(shù)抗原免疫往往效果不佳[21-22]。目前，基于完整細菌的活疫苗或滅活疫苗仍是細菌疫苗研制的主要方向，而向這類疫苗中補充關鍵的保護性抗原或許成為提升疫苗效果的途徑之一。對于Mhp 重組疫苗而言，還需要更多的研究篩選鑒定其保護性抗原，并進行合理的優(yōu)化組合，并配合佐劑研究才有可能獲得免疫效果較為滿意的疫苗。

綜上所述，本研究構建、表達、純化了重組蛋白rCTB-P97R1，利用小鼠動物模型驗證了其可以顯著增強豬支原體肺炎活疫苗的滴鼻免疫效力，同時可提升小鼠對P97R1 關鍵抗原的免疫應答。小鼠免疫試驗數(shù)據(jù)可為后續(xù)的本動物免疫效力試驗提供參考，同時為后期開發(fā)經滴鼻途徑免疫的豬支原體肺炎活疫苗提供了數(shù)據(jù)支持。