鄭玉芳，簡宗輝，段銳銳，魯瓊芬，劉建平，陳培富*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；3.西雙版納傣族自治州畜牧技術(shù)推廣工作站，云南西雙版納666100)

H5N1 高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)和人類健康的人獸共患病。目前中國的禽流感防制主要是采取捕殺并結(jié)合疫苗免疫的策略[1]。有國外學(xué)者報道紅色原雞(Gallus gallus)對H5N1 HPAI 具有較強的抵抗力[2]。茶花雞作為滇南一帶少數(shù)民族馴養(yǎng)紅色原雞形成的半野生雞品種，并與后者存在基因交流，其繼承了紅色原雞豐富的群體遺傳多樣性[3-5]，可能具有類似的遺傳抗病特性。研究發(fā)現(xiàn)，已知主要組織相容性復(fù)合體(MHC)是決定動物抗病力的關(guān)鍵遺傳因素，據(jù)此國外已培育出抗馬立克病的雞品系[6-7]?；讷@得性免疫應(yīng)答水平可視為動物抗病力的間接選擇指標(biāo)，有必要對接種HPAI 疫苗的茶花雞測定其血清特異性抗體效價和效應(yīng)T 細(xì)胞干擾素(IFN-γ)水平，以期找到代表HPAI 抗性的MHC 單倍型或基因型。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 重組禽流感病毒滅活疫苗(H5N1 亞型Re-5 株)為乾元浩生物股份有限公司生產(chǎn)；AIV H5 亞型血凝抑制試驗抗原由哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)；293 只健康脫溫茶花雞由云南省西雙版納茶花雞保種場核心群繁殖，為同一批孵化，飼養(yǎng)條件相同，均僅在1 日齡接種馬立克疫苗，90 日齡后獨立飼養(yǎng)；IFN-γ ELISA 檢測試劑盒Chicken IFN-γ CytoSetTMCatalog#CAC1233 購自Invitrogen 公司。

1.2 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBanK 提供的雞MHC 參考基因序列Z83781 設(shè)計引物(表1)，由昆明擎科生物合成。其中，LEI0258-F/LEI0258-R 為微衛(wèi)星LEI0258 擴增引物，MCW0371-F/MCW0371-R 為微衛(wèi)星MCW0371 擴增引物。

表1 實驗用引物序列Table 1 The sequence of primers used in the experiment

1.3 實驗動物免疫及采血 對293 只健康脫溫茶花雞分別于35 日齡和53 日齡接種同一HPAI 滅活疫苗(H5N1 亞型Re-5 株)(0.4 mL/ 只)，二免前1 d、二免后7 d 均采集翅下靜脈全血約2 mL，自然沉降1 h～2 h，分離血漿和血細(xì)胞，-20 ℃保存。

1.4 血漿抗體效價檢測 參考《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)高致病性禽流感診斷技術(shù)》 GB/T 18936-2003，采用HA-HI 檢測二免前、后的血漿中禽流感抗體效價。采用血凝抑制試驗檢測血漿中H5N1 抗體效價，判定茶花雞的體液免疫應(yīng)答水平。

1.5 血漿IFN-γ 水平檢測 利用IFN-γ ELISA 檢測試劑盒檢測茶花雞血漿中IFN-γ 水平，測定OD450nm值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程y=0.0002x+0.0386，R2=0.9963，根據(jù)樣品的OD450nm值用回歸方程計算對應(yīng)樣品的IFN-γ 的濃度，判定細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

1.6 茶花雞微衛(wèi)星的擴增及測序分析 提取1.3 中采集全血的雞紅細(xì)胞基因組DNA，以此為模板，分別以LEI0258-F/LEI0258-R和MWC0371-F/MWC0371-R為引物配制30 μL 體系，體系組成為：ddH2O 21 μL、10×PCR Buffer (Mg2+)3 μL、2.5 mmol/mL dNTP 2.5 μL、rTaqDNA 聚合酶0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、DNA 模板2 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃40 s、72 ℃40 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物回收純化后克隆至pMD19-T 載體，陽性克隆由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，所獲核酸序列利用Blast 做在線比對分析。

1.7 茶花雞MHC 分型 參考Fulton 通過PCR 擴增獲得的微衛(wèi)星LEI0258 和MCW0371 片段大小與MHC 單倍型的對應(yīng)關(guān)系，對本實驗的茶花雞進(jìn)行MHC 分型。首先篩選出微衛(wèi)星LEI0258 和MCW0371片段大小均可以與已確定的標(biāo)準(zhǔn)對應(yīng)的MHC 純合子組；若兩個微衛(wèi)星不能一一對應(yīng)的，則篩選出個體之間同一微衛(wèi)星序列無重復(fù)的LEI0258 特定擴增片段攜帶組。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 篩選出個體數(shù)量大于或等于5 且已分型成功的微衛(wèi)星LEI0258 攜帶組和MHC 純合子組，利用SPSS 22.0 軟件分別對微衛(wèi)星LEI0258攜帶組和MHC 純合子組與對應(yīng)的二免前、后特異性抗體效價和IFN-γ 水平做單因素方差分析。結(jié)合單因素方差分析結(jié)果，p≤0.05 的判為有顯著性差異，再在其組內(nèi)做多組間比較；p＞0.05 的判為不存在顯著性差異。隨后，篩選出HPAI 免疫應(yīng)答水平較高的微衛(wèi)星LEI0258 特定片段攜帶組和MHC 純合子組。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星長度多態(tài)性檢測結(jié)果 本研究針對293只茶花雞，采用常規(guī)PCR 擴增微衛(wèi)星LEI0258(182 bp～587 bp)，其中兩條帶的為MHC 雜合子，條帶單一的應(yīng)為純合子(圖1)；PCR 擴增微衛(wèi)星MCW0371，大小在199 bp～211 bp(圖2)。共獲得50 種LEI0258長度多態(tài)性片段(表2)，4 種單倍純合子，即MHC基因型(表3)，表明微衛(wèi)星長度多態(tài)性豐富。

圖1 部分茶花雞LEI0258 擴增產(chǎn)物Fig.1 Amplication of LEI0258 in some chickens by PCR

2.2 LEI0258 片段長度與免疫應(yīng)答水平相關(guān)性分析本實驗從已測得的50 種LEI0258 片段中，選個體數(shù)(頻數(shù))≥5，且微衛(wèi)星擴增片段之間無相互重復(fù)的9組LEI0258 特定擴增片段攜帶組(205 bp 組，217 bp組，249 bp 組，283 bp 組，292 bp 組，307 bp 組，319 bp 組，357 bp 組，391 bp 組)，分別對二免前、后抗體效價做單因素方差分析，結(jié)果顯示LEI0258特定擴增片段攜帶組二免前血漿抗體效價差異總體不顯著(p=0.056＞0.05)；二免后血漿抗體效價差異總體極顯著(p=0.006＜0.01)，其中249 bp、307 bp、319 bp片段攜帶組抗體效價分別顯著高于其它6 組的平均值(圖3)。表明攜帶不同LEI0258 片段的茶花雞個體對HPAI 疫苗的抗體應(yīng)答水平存在差異。

圖2 部分茶花雞MCW0371 擴增產(chǎn)物Fig.2 Amplication of MCW0371 in some chickens by PCR

表2 微衛(wèi)星LEI0258 片段長度多態(tài)性Table 2 Length polymorphism fragments of microsatellite LEI0258

表3 MHC 基因型Table 3 MHC genotype

圖3 9 組茶花雞LEI0258 特定擴增片段攜帶組平均血漿抗體效價Fig.3 The average plasma antibody titer means of 9 groups carrying LEI0258 fragments in Chahua chickens

對茶花雞血漿中IFN-γ 水平做單因素方差分析，結(jié)果顯示LEI0258 特定擴增片段攜帶組二免前血漿IFN-γ 水平差異總體不顯著(p=0.739＞0.05)；二免后血漿IFN-γ 水平差異總體極顯著(p=0.009＜0.01)，249 bp、307 bp、319 bp 片段攜帶組IFN-γ 濃度分別顯著高于其它6 組的平均值(圖4)。表明攜帶不同LEI0258 片段的茶花雞個體對HPAI 疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平存在差異。

圖4 9 組茶花雞LEI0258 特定擴增片段攜帶組平均血漿IFN-γ 水平Fig.4 The average plasma IFN-γ level means of the 9 groups carrying LEI0258 fragments in Chahua chickens

2.3 MHC 基因型與免疫應(yīng)答水平相關(guān)性 取樣本量≥5 的MHC 基因型，分別對二免前后血漿特異性抗體效價做單因素方差分析，結(jié)果顯示MHC 基因型組間二免前血漿抗體效價差異總體不顯著(p=0.864＞0.05)；二免后血漿抗體效價差異總體顯著(p=0.035＜0.05)，B17 基因型抗體效價顯著高于其它3 組的平均值(圖5)。表明不同基因型的茶花雞個體對HPAI 疫苗的抗體應(yīng)答水平存在差異。

取樣本量≥5 的MHC 基因型，分別對二免前、后血漿IFN-γ 水平做單因素方差分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHC 基因型組間二免前血漿IFN-γ 水平差異總體不顯著(p=0.436＞0.05)；二免后血漿IFN-γ 水平差異總體顯著(p=0.028＜0.05)，其中B17 基因型顯著高于其它3 組的平均值(圖6)。表明不同基因型茶花雞個體對HPAI 疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平存在差異。

圖5 4 個基因型攜帶者雞平均血漿抗體效價Fig.5 The average plasma antibody titer means for 4 genotypes

圖6 4 個基因型攜帶者雞平均血漿IFN-γ 水平Fig.6 The average plasma IFN-γ level mean of 4 genotypes

3 討 論

目前除哺乳動物外，雞MHC 基因是人類較早研究并且了解最深入的脊椎類動物基因[8]。雞MHC基因在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的作用，與對疾病的抵抗力有著密切的關(guān)系[9-10]。但只有完成MHC 的分型工作才能進(jìn)一步鑒定MHC 的抗病遺傳標(biāo)記。通常認(rèn)為，鑒定MHC 單倍型是開展遺傳育種和抗病研究的基礎(chǔ)。因此，建立行之有效的MHC 分型方法就顯得極其重要。20 世紀(jì)80年代以來，已有多種技術(shù)被用于雞MHC 分型研究，包括血清學(xué)反應(yīng)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和DNA 測序等技術(shù)[11-13]。

有學(xué)者應(yīng)用血清分型方法已完成部分純合子雞的MHC 分型工作，并據(jù)此獲得MHC 單倍型與微衛(wèi)星LEI0258 和MCW0371 的對應(yīng)關(guān)系，因此可以參考這一對應(yīng)關(guān)系，擴增這兩個微衛(wèi)星系列對MHC進(jìn)行分型。本實驗通過常規(guī)PCR 擴增微衛(wèi)星LEI0258 和MCW0371，隨后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行TA 克隆和DNA 測序，最后根據(jù)片段長度大小，完成對293 只西雙版納茶花雞的MHC 單倍型分型。結(jié)果顯示，PCR 擴增LEI0258 獲得50 種長度多態(tài)性片段，包括已有報道被用于MHC 單倍型命名的20 種和新發(fā)現(xiàn)的30 種，其中頻率較高的為205 bp (49.66 %)、292 bp(12.14%)、391 bp(11.56%)、357 bp(10.20%)；而包括182 bp、209 bp、213 bp 等在內(nèi)的19 種LEI0258 片段均僅出現(xiàn)一次。另外，本實驗獲得的片段長度為206 bp、217 bp、247 bp、259 bp、283 bp、488 bp、489 bp 等已有學(xué)者報道[14-15]，證明本實驗結(jié)果可靠。由此表明，微衛(wèi)星LEI0258 擴增片段具有豐富的長度多態(tài)性，這就意味著與其它已報道的雞品種相比，茶花雞可能具有更豐富的MHC 單倍型多態(tài)性。MHC 的多態(tài)性能夠反應(yīng)出基因組水平的多態(tài)性，這種多態(tài)性對生物機體識別外來細(xì)菌、病毒和噬菌體能力及種群適應(yīng)性起到重要作用[16-18]。但有少量已報道LEI0258 片段如420 bp、513 bp、539 bp在本茶花雞實驗群體中未檢測到，可能由于基因漂移導(dǎo)致等位基因在該實驗雞群體中頻率極低或者消失，這將會造成茶花雞遺傳資源無法彌補的流失，提示有必要做好茶花雞的保種工作，避免其遺傳資源的流失。

MHC 的重要作用在于對雞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，MHC 細(xì)胞表面蛋白在區(qū)分自身或非自身免疫中很關(guān)鍵。MHC 細(xì)胞表面抗原與外來抗原和其它免疫細(xì)胞相互作用時產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。 然而要使這些免疫反應(yīng)有效，免疫系統(tǒng)細(xì)胞必須至少有一個單倍型，即MHC 局限性[19]。MHC 不但存在局限性，還存在個體差異性，本次實驗茶花雞免疫HPAI 疫苗后，不同LEI0258 片段攜帶組及MHC 基因型對疫苗的免疫應(yīng)答存在明顯的差異，主要是由于MHC的不同造成的。實驗中用于分析的各LEI0258 特定片段攜帶組或基因型組之間的抗體效價和IFN-γ 水平差異總體均不顯著，可能是由于免疫系統(tǒng)及其淋巴細(xì)胞必須在抗原刺激下才能完全發(fā)育成熟，但初次免疫時茶花雞個體幼小，免疫器官可能還未發(fā)育成熟，另可能與存在母源抗體的干擾有關(guān)。二次免疫后，因首次免疫后產(chǎn)生的記憶淋巴細(xì)胞發(fā)揮關(guān)鍵作用，受抗原刺激后，記憶淋巴細(xì)胞能較快做出再次免疫應(yīng)答，即產(chǎn)生抗體時間較短、抗體親和力升高、抗體效價增高，這可能是二次免疫后LEI0258特定片段攜帶組或基因型組抗體效價和IFN-γ 水平差異顯著的原因。LEI0258 特定擴增片段攜帶組和MHC 基因型二免前、后血漿抗體效價和IFN-γ 水平的單因素方差分析結(jié)果表明，在H5N1 弱毒疫苗的免疫刺激后，不同LEI0258 特定擴增片段攜帶者和MHC 基因型的免疫應(yīng)答水平存在差異，其中微衛(wèi)星LEI0258 319 bp、249 bp、307 bp 攜帶者和B17 純合子具有較高的HPAI 免疫應(yīng)答水平。這可能對通過篩選免疫應(yīng)答效果較好的LEI0258 特定擴增片段攜帶者和MHC 基因型來鑒定潛在的HPAI 抗性單倍型，具有重要的指引意義。對MHC 多態(tài)性或單倍型與疾病抗性關(guān)聯(lián)的研究已成為開展抗病育種、發(fā)展預(yù)測和防控疾病新策略的一個熱點，以最大程度減小由傳染性疾病給養(yǎng)殖業(yè)帶來的嚴(yán)重?fù)p失。本實驗發(fā)現(xiàn)B17 單倍型可能代表對HPAI 的抗性，值得深入研究。