李曉云，韓彩霞，陰 玥，胡 靜，張 妍，孟 詩，孟小晴，宋銘忻

(東北農業(yè)大學動物源性人獸共患病黑龍江省重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030)

旋毛蟲病是由旋毛蟲感染引起的一種嚴重的人畜共患寄生蟲病，主要病征是發(fā)熱，肌肉炎癥性疼痛，四肢酸困無力等，嚴重者可因心肌炎等并發(fā)癥導致死亡[1]。宿主被感染的過程中蟲體可產生各類抗原，其中排泄分泌(Excretory-secretory，ES)抗原，直接暴露于宿主免疫系統(tǒng)，是誘導宿主產生免疫應答反應的主要靶抗原[2]。宿主天然免疫系統(tǒng)通過模式識別受體在第一時間發(fā)現(xiàn)、識別并抵抗病原體的入侵。其中NOD1 受體作為模式識別受體家族NLRs 中一種重要的天然免疫受體，廣泛存在于多種組織細胞中[3-4]。一般NOD1 受體被病原體激活后可活化下游的效應分子RIP2，能夠引起caspase-1、NF-κB、MAPKs 等信號通路被激活，誘導TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎性因子分泌，進而引起多種免疫應答反應[5]。目前NOD1 受體的研究主要集中在細菌感染方面[6-8]，關于NLRs 在寄生蟲感染中作用的研究相對較少，且主要集中在原蟲感染方面[9-11]，在線蟲感染方面的報道鮮見。

本實驗通過旋毛蟲肌幼蟲ES 抗原體外作用于健康小鼠腹腔巨噬細胞，觀察NOD1 受體與其信號通路中關鍵分子以及相關細胞因子的表達動態(tài)，初步探究了旋毛蟲ES 抗原對宿主巨噬細胞NOD1 受體通路的影響。應用熒光定量PCR 對細胞內NOD1、RIP2 和NF-κB 基因轉錄水平進行監(jiān)測，western blot 對細胞內NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65 表達量進行測定，ELISA 測定細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量的變化，探究旋毛蟲與宿主天然免疫系統(tǒng)相互作用的機制，為臨床旋毛蟲病的防治和了解旋毛蟲對宿主的感染機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 蟲種與實驗動物 黑龍江豬旋毛蟲蟲株由本實驗室傳代保存，2 月齡昆明系小鼠，購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑 rTaq聚合酶、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、pMD18-T 載體、DH5α 感受態(tài)細胞、TRIzol、MLV和RRI，均購自寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取、膠回收試劑盒、兔源β-actin 內參MAb 和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG (IgG-HRP)二抗均購自北京全式金生物技術有限公司；兔源NOD1 單克隆抗體(MAb)、RIP2 MAb、NF-κB p65 MAb 和NF-κB p-p65 MAb 均購自北京博奧森公司；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 檢測試劑盒均購自北京誠林生物科技有限公司；RIPA 裂解液為碧云天產品。

1.3 旋毛蟲ES 抗原的制備 取本實驗室保種的旋毛蟲肌幼蟲，每只鼠經口喂入200 條幼蟲使之感染，在感染后的35 d 迫殺小鼠，取其肌肉攪碎并按比例加入人工胃液消化4 h，消化液中加入清水反復洗滌沉淀，收集底層蟲體。收集的蟲體用含雙抗的滅菌生理鹽水清洗5 次，加入到1640 培養(yǎng)基中，密度為5 000 條/mL，37 ℃5 % CO2培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液離心后將上清液裝入透析袋中透析，然后用PEG 5000 濃縮，所得ES 抗原經0.22 μm 濾器過濾后應用SDS-PAGE 進行檢測，并測定蛋白含量，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 旋毛蟲ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響 取健康的小鼠脫頸處死，無菌腹腔注射5 mL已提前預冷的1640 培養(yǎng)液，輕柔小鼠腹部5 min 后吸出灌洗液，并將不同小鼠的腹腔巨噬細胞均勻混和在一起，貼壁培養(yǎng)2 h 后，用細胞刮刀刮取，計數(shù)，按1×106個細胞/ 孔接種于六孔板。加入ES 抗原使其濃度分別為0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL 和40 μg/mL，同時設置重復孔，培養(yǎng)12 h 后應用臺盼藍染色法分別計算各濃度作用下的活巨噬細胞數(shù)。

1.5 不同濃度ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞NOD1轉錄水平的影響 將腹腔巨噬細胞按1×106個細胞/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 mL，肌幼蟲ES 抗原按濃度梯度0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL 和25 μg/mL 與巨噬細胞作用12 h，每組設置重復孔。培養(yǎng)結束后，應用TRIzol 法提取巨噬細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，利用文獻[12]中的熒光定量PCR 方法檢測NOD1、RIP2、NF-κB mRNA 轉錄水平。

1.6 ES 抗原誘導小鼠腹腔巨噬細胞NOD1 轉錄的時間效應 按步驟1.5 確定好的ES 抗原劑量作用于巨噬細胞，測定時間對NOD1 mRNA 轉錄水平的影響。將巨噬細胞按1×106個細胞/ 孔接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 mL，ES 抗原按時間梯度(0、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h)作用于巨噬細胞，每組設置重復孔。培養(yǎng)結束后，同步驟1.5 對巨噬細胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA 轉錄水平進行熒光定量PCR 檢測[12]。

1.7 Western blot 檢測ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2、NF-κB p65 和NF-κB p-p65 蛋白表達量的影響 按1.5 確定的ES 抗原濃度，1.6確定的作用時間，與小鼠腹腔巨噬細胞共培養(yǎng)，同時設置空白對照組(PBS 組)和ES 抗原組，每組設置重復孔。細胞培養(yǎng)結束后，加入PMSF 的RIPA 裂解液處理細胞，提取其總蛋白，分別以NOD1、RIP2、NF-κB p65 和NF-κB p-p65 兔源MAb 為一抗(1∶5 000)，羊抗兔HRP-IgG (1∶10 000)為二抗，利用western blot 檢測NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65 蛋白水平。

1.8 ELISA 測定巨噬細胞培養(yǎng)上清中細胞因子含量取步驟1.7 所得小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液，應用ELISA 試劑盒按說明書操作對其中細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量進行測定。

1.9 數(shù)據(jù)分析 應用 EXCEL、 ABI7500Fast、SPSS21.0、Image J 和GraphPad Prism 5 對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 旋毛蟲ES 抗原的制備 將收集的肌幼蟲于1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲取旋毛蟲ES 抗原，所得培養(yǎng)液經透析、濃縮、過濾并測定蛋白含量后，應用SDS-PAGE 檢測ES 抗原的制備和收集情況，結果顯示目的蛋白條帶主要位于43 ku ～53 ku (圖1)，表明制備的ES 抗原質量較好。

圖1 ES 抗原的SDS-PAGE 分析Fig.1 Detection of ES antigen expression by SDS-PAGE

2.2 旋毛蟲ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響 取健康小鼠腹腔巨噬細胞與不同濃度ES 抗原共同培養(yǎng)12 h 后應用臺盼藍染色法檢測，結果顯示當ES 抗原濃度在0～20 μg/mL 時，對細胞活力影響不大，當濃度達到并高于25 μg/mL 后，細胞活力明顯下降(p＜0.01)(圖2)。表明ES 抗原在低于25 μg/mL 時，不會影響巨噬細胞活力。

圖2 ES 抗原濃度對巨噬細胞活力的影響Fig.2 The effects of ES concentration on macrophages vitality

2.3 不同濃度ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2 和NF-κB 轉錄水平的影響 將小鼠腹腔巨噬細胞與不同濃度(在一定范圍內梯度增加)的旋毛蟲ES 抗原共同培養(yǎng)一定時間，檢測ES 抗原濃度對巨噬細胞中各目的基因mRNA 轉錄水平的影響。結果顯示，隨著濃度增加，各目的基因轉錄水平在抗原濃度為15 μg/mL 時均達到最大值，分別為對照組轉錄水平的2.0 倍，3.6 倍和2.5 倍，之后mRNA 轉錄水平逐漸下降，不再隨ES 抗原濃度的增加而增加(圖3)。表明旋毛蟲ES 抗原可以引起巨噬細胞各目的基因轉錄水平升高，但超過一定濃度的ES 抗原刺激導致細胞出現(xiàn)一定程度的免疫抑制。所以后續(xù)實驗選擇15 μg/mL 作為ES 抗原與巨噬細胞相互作用濃度。

圖3 篩選ES 抗原誘導小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2 和NF-κB 表達的最適劑量(n=5)Fig.3 Dose-effects of ES antigen on the transcription of NOD1,RIP2 and NF-κB in peritoneal macrophage from mice (n=5)

2.4 ES 抗原誘導小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2和NF-κB 轉錄的時間效應 將小鼠腹腔巨噬細胞與15 μg/mL 的旋毛蟲ES 抗原作用不同時間，檢測作用時間對細胞各目的基因mRNA 水平的影響。結果顯示，隨著時間的增加，NOD1、RIP2 和NF-κB mRNA 水平先逐漸升高，分別于9 h、9 h 和12 h 時達到最高值，分別為作用前的2.0 倍、3.2 倍和3.3倍，之后各目的基因mRNA 水平逐漸下降，不再隨作用時間的增加而增加，24 h 時NOD1 mRNA 已顯著低于作用前的mRNA 水平(p＜0.01)(圖4)。表明旋毛蟲ES 抗原能夠誘導巨噬細胞各目的基因mRNA 水平升高，但當作用時間超過一定值時亦可引起免疫耐受。在相同ES 抗原作用濃度時，后續(xù)實驗選擇9 h 作為相互作用時間。

2.5 Western blot 檢測ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2、NFκB p65、NF-κB p-p65 蛋白表達的影響 將濃度為15 μg/mL ES 抗原作用于腹腔巨噬細胞9 h 后，收集巨噬細胞提取總蛋白，采用western blot 檢測各目的基因蛋白表達水平。結果顯示巨噬細胞中NOD1、RIP2 和NF-κB p-p65 的蛋白表達量均顯著增加，與對照組比差異極顯著(p＜0.01)，NF-κB p65 表達量與對照組比較則顯著減少(p＜0.05)，可能是由于NF-κB p65 被激活并磷酸化轉入細胞核內，表現(xiàn)為與NF-κB p-p65 呈反向表達(圖5)。表明巨噬細胞在ES 抗原刺激下，各目的基因蛋白(除NF-κB p65 外)表達量升高，與熒光定量PCR 檢測mRNA 結果基本一致，在蛋白水平上進一步驗證了ES 抗原對巨噬細胞NOD1 受體通路的影響。

圖4 ES 抗原誘導小鼠腹腔巨噬細胞NOD1、RIP2 和NF-κB表達的時間效應Fig.4 Time-effects of ES antigen on the transcription of NOD1,RIP2 and NF-κB in peritoneal macrophage from mice

圖5 Western blot 檢測巨噬細胞中各目的基因蛋白表達量Fig.5 Detection of protein expressions of target genes in macrophages by western blot

2.6 ELISA 測定巨噬細胞培養(yǎng)上清中細胞因子含量采用濃度15 μg/mL 的ES 抗原作用小鼠腹腔巨噬細胞9 h 后，ELISA 測定炎性因子的含量。結果顯示各炎性因子TNF-α、IL-1β、L-6 的含量均顯著升高，與對照組相比差異極顯著(p＜0.01)(表1)。表明ES抗原能夠促進炎性因子分泌，另也表明ES 抗原對小鼠腹腔巨噬細胞NOD1 受體通路的影響。

3 討論

旋毛蟲在宿主體內的不同發(fā)育時期，均可以通過ES 抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用[2]。由于肌幼蟲期是旋毛蟲主要的致病時期，并且肌幼蟲排泄分泌抗原較易制備，因此本實驗選擇旋毛蟲肌幼蟲ES 抗原來探究其對宿主巨噬細胞NOD1 受體通路的影響。

隨著近年來對固有免疫系統(tǒng)識別病原體抗原機制的深入了解，由細胞編碼的病原識別受體家族逐漸被發(fā)現(xiàn)并被普遍接受[13]。NOD 樣受體作為一種胞內模式識別受體，其通過識別侵入細胞的內部信號來調控機體的天然免疫系統(tǒng)。有研究表明，NLRs在抵御寄生蟲對宿主的入侵有關鍵作用[9-11]，其在線蟲感染中作用的相關研究鮮見報道。Ilic 等應用旋毛蟲ES 抗原與人胚腎細胞(HEK-BlueTM)的模式識別受體(PRRs)相互作用，將HEK-hNOD1 細胞與ES 抗原共同培養(yǎng)4 h 和24 h 后，SEAP (分泌型堿性磷酸酶)活性水平與對照細胞相比變化不明顯，表明人胚腎細胞NOD1 受體沒有參與ES 抗原介導的相互作用[14]。在本實驗中旋毛蟲ES 抗原是如何調控激活巨噬細胞NOD1 受體通路，是否與受體細胞及ES 抗原劑量等的差異有關，其作用機制還需要深入的研究。

表1 巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的檢測(n=5)Table 1 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in supernatant of cultured macrophages (n=5)

熒光定量PCR 檢測巨噬細胞NOD1、RIP2 和NF-κB 基因轉錄水平結果表明，細胞中NOD1、RIP2 和NF-κB mRNA 水平對ES 抗原均呈現(xiàn)一定的時間和劑量依賴性，但當作用時間和作用濃度超過一定值時，各目的基因mRNA 轉錄水平均表現(xiàn)為下降趨勢，甚至低于對照組，表明ES 抗原誘導小鼠腹腔巨噬細胞出現(xiàn)了免疫耐受現(xiàn)象。Western blot 測定細胞內NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表達量，ELISA 測定細胞培養(yǎng)上清中炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量變化，均與熒光定量PCR結果相似，從另一角度說明旋毛蟲ES 抗原可以激活并調節(jié)巨噬細胞NOD1 受體通路，使細胞內NOD1、RIP2 和NF-κB p-p65 蛋白表達量增加，細胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 分泌量增多。以上實驗結果表明旋毛蟲肌幼蟲ES 抗原在一定的劑量和時間，可以激活并調節(jié)小鼠腹腔巨噬細胞中NOD1受體通路，上調NOD1 受體通路中關鍵分子RIP2和下游分子NF-κB 的表達，促進細胞因子TNF-α 和IL-6 的分泌；同時也表明，ES 抗原在超過一定的時間和濃度可以導致NOD1 受體免疫抑制。由于ES抗原成分及與宿主免疫反應的復雜性，其具體作用機制還需進一步的研究。