劉 金，王占新，陳 彤，魯俊鵬

(溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮527439)

雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)是單股正鏈RNA 病毒，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬第III 抗原群成員，主要在呼吸道和泌尿生殖系統(tǒng)復(fù)制。其編碼的結(jié)構(gòu)蛋白核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，N)參與病毒的復(fù)制與組裝，與前導(dǎo)RNA 序列的相互作用有助于病毒mRNA 的合成，同時(shí)與RNA 結(jié)合形成螺旋狀核衣殼[1-4]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)IBV N 蛋白與S 蛋白類似，同樣具有抗原決定簇，存在免疫識(shí)別相關(guān)位點(diǎn)，它的T 細(xì)胞表位蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫[5-6]。同時(shí)，以前認(rèn)為高度保守的N 基因，隨著免疫壓力、基因突變、基因重組等原因，也在不斷改變[7-10]。因此，了解IBV N 基因在黃羽肉雞中的遺傳進(jìn)化規(guī)律，對(duì)IBV 分子流行病學(xué)研究具有重要意義。本研究對(duì)2017年從我國(guó)廣西、云南、山東等地黃羽肉雞中分離鑒定的IBV 株進(jìn)行N 基因克隆、測(cè)序及分析，探究其在黃羽肉雞中的分子流行病學(xué)和遺傳變異特征。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 16 株IBV 分離株由本實(shí)驗(yàn)室于2017年分離自廣西、云南、山東等地(表1)。一步法RT-PCR 反應(yīng)試劑、DNA Marker 購自寶生物工程(大連)有限公司；Magen RNA 提取試劑盒購自Magen 生物；SPF 雞胚購自廣東溫氏新興大華農(nóng)禽蛋公司SPF 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

表1 2017年從國(guó)內(nèi)分離的16 株IBV 背景Table 1 Backgrounds of 16 IBVs isolated in China in 2017

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer5.0 軟件，參照GenBank 中登錄的IBV N 基因序列(GU393335)，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物，序列如下：IBVNF：GTGTGGT AGGCGAGTGCTTTTA； IBVNR： GGCGTCCTAGT GCTGTAC，引物由華大基因公司合成，目的片段長(zhǎng)度約為1 900 bp。

1.3 IBV 的增殖與RNA 抽提 將16 株IBV 分別經(jīng)尿囊腔接種于10 日齡SPF 雞胚，37 ℃培養(yǎng)48 h 后無菌收取尿囊液，-70 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誐agen RNA 抽提試劑盒說明方法提取病毒RNA。

1.4 IBV N 基因的擴(kuò)增及測(cè)序 以提取的病毒RNA 為模板，應(yīng)用RT-PCR 方法對(duì)各病毒株的N 基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：50 ℃30 min；94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃2 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽性PCR 產(chǎn)物由華大基因公司測(cè)序。

1.5 N 基因核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列分析將測(cè)序后的16 株IBV N 基因序列采用Mega5.0、DNAStar 軟件進(jìn)行核苷酸序列及推導(dǎo)氨基酸序列分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 N 基因的擴(kuò)增、測(cè)序及分析 16 株IBV 分離株均擴(kuò)增出約為1 900 bp 的目的片段。對(duì)16 株分離株進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示：16 株分離株N 基因全長(zhǎng)均為1 230 bp，編碼409 個(gè)氨基酸，未出現(xiàn)堿基缺失和插入。采用MEGA5.0 和DNAStar 軟件對(duì)各分離株N 基因核苷酸序列與參考病毒株進(jìn)行比對(duì)分析。16 株IBV 分離株之間N 基因序列同源性為85.9 %～99.9 %，其中SDGM-DHJ、YNSL-AYF、SDGM-CYG 等3 株與疫苗株H120 參考株同源性較高為99.8 %～99.9 %，與其余13 株分離株同源性均小于91.2 %；16 株IBV 分離株之間推導(dǎo)氨基酸同源性為89 %～99.8 % ， 其中SDGM-DHJ 與YNSL-AYF 推導(dǎo)氨基酸同源性為99.8 %，同源性較高。以H120 疫苗株為參考株，由核苷酸突變導(dǎo)致氨基酸改變區(qū)域主要集中在aa4 ～aa16、aa38 ～aa50、aa64、aa117～aa125、aa209～aa237、aa334～aa366。表明隨著IBV 的流行，其N 基因也出現(xiàn)一定的變異。

2.2 N 基因遺傳進(jìn)化分析 應(yīng)用MEGA5.0 軟件可將所分離的16 株IBV 分離株的N 基因分為3 個(gè)大群，12 株分離株屬于QX-Like 型，1 株分離株屬于4/91-Like 型，3 株屬于Mass-Like 型(圖1)。表明N基因在我國(guó)存在多種基因型，但在我國(guó)部分地區(qū)黃羽肉雞中主要以QX-Like 型為主，這可能與我國(guó)目前IBV 流行株為QX 型有關(guān)[7-8]。

圖1 16 株IBV 分離株N 基因進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree based on the N gene of the 16 IBV isolates

2.3 IBV N 蛋白3 個(gè)保守堿性氨基酸區(qū)序列分析以IBV H120、變異株4/91、QX 為參考株，對(duì)16 株IBV 分離株N 蛋白的3 個(gè)保守堿性氨基酸區(qū)序列進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：以H120 疫苗株為參考株，SDGM-DHJ 與YNSL-AYF 與H120 株在3 個(gè)堿性氨基酸區(qū)無氨基酸替換與突變，GXLC-WXQ 分別在77 位(Y-F)、192 位(A-S)、342-343 位(PN-SS)、360位(Q-P)出現(xiàn)氨基酸突變；以4/91 為參考株，SDGM-CYG 在3 個(gè)氨基酸保守區(qū)域無氨基酸替換與突變；以QX 型為參考株的13 株分離病毒株，在aa79 ～aa80，aa189 ～aa190、aa192 ～aa195，aa223，aa334～aa336，aa342～aa343，aa345，aa350～aa351，aa360 等均出現(xiàn)不同程度的氨基酸突變(表2)。表明IBV N 蛋白3 個(gè)保守堿性氨基酸區(qū)的保守性也產(chǎn)生了一定的突變，這些突變可能會(huì)改變IBV 誘導(dǎo)宿主B 淋巴細(xì)胞，以及機(jī)體對(duì)IBV 的CTL 反應(yīng)。

近年來的研究表明，N 基因存在某些抗原表位及功能區(qū)域[11]，N 基因的核苷酸點(diǎn)突變以及由此導(dǎo)致的氨基酸殘基的改變可能導(dǎo)致IBV 生物學(xué)特性改變及IBV 發(fā)生變異。因此，針對(duì)IBV 流行株N 基因的遺傳變異研究，對(duì)闡明IBV 基因組的遺傳進(jìn)化及其分子流行病學(xué)特征具有重要作用。

表2 16 株IBV 分離株N 蛋白3 個(gè)保守堿性氨基酸區(qū)內(nèi)不同位點(diǎn)氨基酸差異Table 2 Differences of the 3 conserved basic amino acids regions of N gene in 16 isolates