劉麗娟，尹燦燦，關(guān) 書，葛會香，王聰睿，高 云，熊 偉,4

(1. 南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院預(yù)防科，江西 南昌 330019;2. 南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 南昌 330006;3. 南昌大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330019;4. 江西省口腔生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330019)

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是三叉神經(jīng)分布區(qū)域受到某些觸覺刺激，如咀嚼、說話、微笑、洗臉、剃毛、刷牙等，引發(fā)的劇烈疼痛。有時(shí)可伴有面部的痛性痙攣[1]。通常TN常見于中老年女性，估計(jì)年發(fā)病率在每10萬人中有4～13人。據(jù)統(tǒng)計(jì)，TN更易發(fā)生在右側(cè)面部，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotropic factor，BDNF)是神經(jīng)生長因子家族成員之一。BDNF高親和力受體TrkB目前已被證實(shí)與神經(jīng)元的存活、突觸的可塑性和完整性密切相關(guān)[3]。BDNF/TrkB通路在神經(jīng)退行性變中表達(dá)減低[4-5]，通過給予相應(yīng)藥物，增加BDNF表達(dá)，以改善抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙等[6]。近年來，對BDNF與慢性疼痛的研究日益深入。有學(xué)者報(bào)道，坐骨神經(jīng)痛模型中，某些炎癥因子可促進(jìn)BDNF/TrkB表達(dá)增加，進(jìn)而使機(jī)械痛縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)降低[7]。在口腔頜面部疼痛，如急慢性牙髓炎[8]、帶狀孢疹引起[9]的神經(jīng)性疼痛中，三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglion，TG)的BDNF分泌增加。上述研究均證實(shí)，BDNF與慢性疼痛密切相關(guān)。但在TN的TG中，BDNF及其受體TrkB的表達(dá)變化及可能機(jī)制的報(bào)道較少。本研究采用眶下神經(jīng)慢性損傷壓迫模型(infraorbital nerve chronic injury compression model, ION-CCI)制備TN大鼠動(dòng)物模型，觀察TN大鼠TG中BDNF及其受體TrkB的表達(dá)變化，旨在明確BDNF及其受體TrkB是否促進(jìn)TN的痛覺傳遞。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD成年♂大鼠，體質(zhì)量(180～220) g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，動(dòng)物許可證號：SCX(贛)2018-0003。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)和TN模型組，在實(shí)驗(yàn)開始前3 d使大鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在光照周期(12 h ∶12 h)中，在一天的同一時(shí)間(9 ∶00～14 ∶00)測試所有動(dòng)物。

1.2試劑BDNF及TrkB抗體(美國Abcam公司)；q-PCR實(shí)驗(yàn)所需引物，購自上海生工；DAB試劑盒、SP-9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Triton X-100(Solarbio公司)；RNA提取試劑盒(TIANGEN公司)；山羊抗小鼠FITC、山羊抗兔TRITC(EarthOx公司)；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Trans Gen公司)；抗熒光衰減封片劑(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)。

1.3儀器BME-403 Von Frey(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所)；Step one plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Life)；冰凍切片機(jī)(德國徠卡公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

2 方法

2.1TN模型的建立根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)，TN模型按如下方法建立：SD大鼠按3 mL·kg-1腹腔注射100 g·L-1水合氯醛,待麻醉后，剃除大鼠右側(cè)面部觸須及毛發(fā)，13.12 μmol·L-1酒精消毒術(shù)區(qū)，于大鼠眶下緣約3～4 mm,緊貼鼻根處，沿鼻骨方向長約3～5 mm切口，用4-0鉻制羊腸線松松接扎眶下神經(jīng)，共2道，相隔至少約1 mm。假手術(shù)組僅暴露右側(cè)眶下神經(jīng)，但不接扎，其余所有操作同TN組。手術(shù)過程中，所用物品均高壓滅菌。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2機(jī)械性痛閾的測定各組大鼠分別在術(shù)前3、2、1 d行機(jī)械刺激適應(yīng)，術(shù)后d 1開始，每隔1 d用電子測痛儀刺激眶下神經(jīng)分布區(qū)域。每只大鼠刺激6次，間隔1 min。出現(xiàn)以下行為中任意1項(xiàng)則認(rèn)為是有效刺激,該刺激強(qiáng)度即為疼痛閾值[10]：(1)非對稱性面部搔抓；(2)攻擊行為；(3)躲避刺激物。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測術(shù)后d 14，大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉，取手術(shù)側(cè)TG，于RNA保存液中，置于-80 ℃保存。待用時(shí)，將組織取出，根據(jù)試劑盒說明書提取RNA，測定RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃?zhèn)溆?。引物序列見Tab 1。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。通過熔解曲線確定擴(kuò)增的特異性，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算相應(yīng)組mRNA表達(dá)量。

Tab 1 Primers used for qPCR

2.4免疫組織化學(xué)檢測術(shù)后14 d，麻醉大鼠后，對大鼠進(jìn)行經(jīng)心尖灌注，灌注完成后，取右側(cè)TG，4%多聚甲醛4 °C固定過夜。0.3 g·L-1的蔗糖對組織脫水24 h，每8 h換液，4 ℃過夜。冰凍切片機(jī)將組織切成厚8 μm，室溫過夜后，放置-20 ℃冰箱。取切片，置內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑作用10 min，3 mL·L-1Triton X-100作用10 min,進(jìn)口山羊工作血清37 ℃水浴孵育40 min，一抗(BDNF 1 ∶25，TrkB 1 ∶100)4 ℃孵育過夜。次日，經(jīng)PBS沖洗后，37 ℃水浴孵育SP試劑盒B液40 min, 以上各步驟之間用PBS(0.01 mmol·L-1)沖洗5 min×3次,DAB試劑染色，滴加PBS，終止反應(yīng)，不同濃度乙醇脫水，新鮮二甲苯透明，中性樹膠封片劑封片。倒置顯微鏡下拍照，保存并分析反應(yīng)密度。

2.5免疫熒光雙標(biāo)檢測術(shù)后14 d，取右側(cè)TG冰凍切片，平衡室溫后，山羊血清封閉1 h，反應(yīng)溫度為37 ℃。濾紙拭干多余封閉液，加入一抗BDNF(1 ∶500)、神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear protein, NeuN)(1 ∶200)、TrkB(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日，室溫放置0.5 h后，避光加入熒光二抗(FITC、TRITC均為1 ∶200)37 ℃恒溫水浴1 h，以上各步驟之間都需0.01 mmol·L-1緩沖液沖洗，每次10 min×3次?？篃晒馑p劑封片。顯微鏡下拍照，分析結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1行為學(xué)觀察術(shù)后14 d內(nèi)，對各組每只大鼠行機(jī)械性痛敏檢測。如Fig 1所示，TN組大鼠較假手術(shù)組手術(shù)側(cè)面部機(jī)械痛敏閾值明顯下降(P<0.01)。術(shù)后d 1,TN組大鼠較假手術(shù)組大鼠機(jī)械閾值明顯降低。

Fig 1 Changes of mechanical withdrawal threshold

**P<0.01vssham

3.2qPCR結(jié)果如Fig 2所示，術(shù)后d 14，與假手術(shù)組比較，TN組大鼠右側(cè)TG中BDNF、TrkB、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。

Fig 2 Relative mRNA expression in TGs of each

*P<0.05,**P<0.01vssham

3.3免疫組織化學(xué)結(jié)果術(shù)后14 d,采用免疫組化方法測量TG中BDNF、TrkB的表達(dá)。如Fig 3所示，與假手術(shù)組相比，TN組中BDNF及TrkB的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。

Fig 3 Expression of relative protein in TGs of each group

Arrows indicate the immunostaining neurons. Scale bar:50 μm.*P<0.05vssham.

3.4免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果術(shù)后d 14，采用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測TG中BDNF、TrkB分別與NeuN共表達(dá)的情況。Fig 4結(jié)果顯示，TG中BDNF、TrkB與NeuN共同表達(dá)于神經(jīng)元；與假手術(shù)組相比，TN組中BDNF及TrkB表達(dá)明顯增加。

Fig 4 The double-labeled expression in TGs of each group

Arrows indicate the immunostaining neurons. Scale bar:50 μm.*P<0.05vssham.

4 討論

目前，TN的發(fā)病原因仍不明確，但被廣泛接受的是神經(jīng)血管壓迫學(xué)說[11]。除此之外，三叉神經(jīng)根周圍結(jié)構(gòu)解剖異常、動(dòng)靜脈畸形或腫瘤中樞腦干功能障礙也可引起TN[12]?，F(xiàn)TN的治療可分為藥物治療及非藥物治療，但都有不同弊端。因此，對TN的發(fā)病機(jī)制及分子變化的研究顯得極其重要。如前所述，目前大量研究均證實(shí)，BDNF與慢性疼痛密切相關(guān)，可能影響TG對頜面部疼痛的傳遞[7-8]。但在TN的TG中BDNF及其受體TrkB的表達(dá)變化及可能機(jī)制的報(bào)道較少，值得進(jìn)一步深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)采用TN動(dòng)物模型，觀察TG中BDNF及其受體TrkB的表達(dá)變化。

目前沒有完全符合臨床表現(xiàn)的理想TN動(dòng)物模型，Vos等[13]采用ION-CCI建立了TN動(dòng)物模型，該模型簡單、易操作，能較好地模擬臨床三叉神經(jīng)受壓引起的痛覺超敏現(xiàn)象，對TN的研究有很大幫助。本實(shí)驗(yàn)通過采用ION-CCI建立TN動(dòng)物模型，術(shù)后14 d內(nèi)，TN組較假手術(shù)組機(jī)械痛敏值明顯降低，說明TN動(dòng)物模型制備成功。應(yīng)用qPCR、免疫組化及免疫熒光雙標(biāo)方法檢測，結(jié)果顯示，TN大鼠手術(shù)側(cè)TG中BDNF、TrkB mRNA及蛋白水平較假手術(shù)組明顯升高，且BDNF、TrkB與NeuN共同表達(dá)。我們推測，結(jié)扎大鼠眶下神經(jīng)可能使TG過度合成和釋放BDNF，促進(jìn)了局部BDNF濃度升高，導(dǎo)致了TrkB的異常表達(dá)升高，促進(jìn)了痛覺傳遞。

與此同時(shí)，與假手術(shù)組相比，TN組中的促炎癥因子TNF-α及IL-1β表達(dá)水平明顯升高。有報(bào)道，采用慢性壓迫坐骨神經(jīng)制備神經(jīng)病理痛大鼠模型發(fā)現(xiàn)，脊髓背角中BDNF、IL-1β和TNF-α表達(dá)水平升高，促進(jìn)痛覺的傳遞[14]。因此，我們推測，在TN狀態(tài)下，TG的BDNF、TrkB表達(dá)增強(qiáng)和局部的炎癥因子水平升高有一定的關(guān)系，有可能存在相互促進(jìn)升高，加重痛覺過敏的作用。BDNF及其受體TrkB有可能是TN治療的有效靶點(diǎn)。

總之，TN的病因繁多，病理表現(xiàn)錯(cuò)綜復(fù)雜，仍需對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究，以尋找更安全有效的治療方法。