劉 濤，李 晶，鮑翠玉

(湖北科技學(xué)院1. 藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100)

隨著人口老年化、城市化進(jìn)展加快、人們生活條件的改善，糖尿病(diabetes mellitus，DM)呈快速增長(zhǎng)和低齡化的趨勢(shì)，目前全球患病人數(shù)已達(dá)4.25億，預(yù)計(jì)2045年可達(dá)6.29億，我國(guó)糖尿病患者人數(shù)眾多，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)[1-2]。糖尿病對(duì)全身大、小血管危害較大，50%～80% DM患者死亡的主要原因?yàn)樾难懿l(fā)癥[3]。然而，DM是如何引起心血管損傷的，目前尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，高脂毒性在DM早期就對(duì)心肌產(chǎn)生不良影響，并且脂毒性的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于糖毒性[4]，DM患者將過(guò)度攝取的脂肪酸積聚在心臟，引起心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，引起脂毒性心肌病[5]。目前，許多學(xué)者圍繞脂毒性對(duì)心肌損傷及其機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)脂代謝調(diào)控與線粒體通路調(diào)控二者之間存在一定聯(lián)系[6]。有文獻(xiàn)指出[7]，DM患者的高脂血癥增加心肌細(xì)胞線粒體損傷，并增加細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，最終使心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，但線粒體凋亡通路是否介導(dǎo)了高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察高脂對(duì)H9c2心肌細(xì)胞增殖、線粒體膜電位、ROS水平、線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討高脂所致H9c2心肌細(xì)胞的損傷或凋亡與線粒體通路之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 H9c2大鼠心肌細(xì)胞，購(gòu)于上海通派生物有限公司。

1.1.2試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清、MTT(美國(guó)Gibco公司)；棕櫚酸(palmitic acid，PA)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DAPI染液(武漢谷歌生物有限公司)；細(xì)胞ROS試劑盒、ECL試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)；線粒體膜電位試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；Annexin V FITC-PI細(xì)胞凋亡試劑盒(南京建成生物工程研究所)；抗Bcl-2、Bax、Cyt-C、Cleaved casepase-3抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)；HVE-50 高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE公司)；垂直式電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1PA的配制 精密稱取PA粉末25.642 mg倒入EP管中，然后加入1 mL無(wú)水乙醇，將EP管進(jìn)行超聲震蕩至完全溶解后，使用濾膜過(guò)濾，制備PA母液濃度為100 mmol·L-1。使用前，37 ℃水浴鍋將PA儲(chǔ)存液完全溶解至無(wú)沉淀物，使用時(shí)，將PA按不同濃度與0.5% BSA的DMEM培養(yǎng)基混合。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和雙抗)中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)，用含0.25% EDTA胰酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 ① PA濃度梯度:分為對(duì)照組、PA(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)組；②PA時(shí)間梯度：分為對(duì)照組、PA作用不同時(shí)間(12、24、36、48 h)組；③為了評(píng)估線粒體凋亡通路在脂毒性心肌損傷中的作用，按PA濃度梯度分組，刺激時(shí)間為24 h。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1MTT法檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞增殖率 在相應(yīng)的板中接種H9c2心肌細(xì)胞懸液(細(xì)胞2×107～2×108·L-1，每孔100 μL)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度含PA的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，加入DMSO；在570 nm處檢測(cè)各孔OD值，按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對(duì)照組OD值×100%。

1.3.2細(xì)胞ROS的檢測(cè) 向24孔板每孔接種500 μL H9c2心肌細(xì)胞懸液過(guò)夜，不同濃度含PA的高糖DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用不含胎牛血清的DMEM清洗2遍，按1 ∶500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制ROS試劑盒試劑，每孔加入500 μL配制好的試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室溫靜置10 min，1×PBS清洗2遍后，收集細(xì)胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察，拍照。

1.3.3檢測(cè)細(xì)胞凋亡 24孔板每孔接種500 μL H9c2心肌細(xì)胞懸液過(guò)夜，不同濃度含PA的高糖DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定10 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。每孔加入400 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再向每孔加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱等待10 min。用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min，封片后，用共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

1.3.4線粒體膜電位的檢測(cè) 向24孔板每孔接種500 μL H9c2心肌細(xì)胞懸液過(guò)夜，不同濃度含PA的高糖DMEM培養(yǎng)基處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每次5 min。加入500 μL培養(yǎng)液，再加入500 μL JC-1染色工作液，37 ℃孵育20 min。孵育后，棄上清，用JC-1(1×)洗2次，加入2 mL培養(yǎng)液，用共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)膜電位。

1.3.5蛋白免疫印跡檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS清洗并裂解刮凈細(xì)胞，收集到離心管中，離心，取上清液，BCA法蛋白定量后。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，線粒體通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育1 h，用ECL顯影液處理，經(jīng)凝膠成像儀檢測(cè)Cyt-C、Cleaved casepase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1高脂刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞增殖率的影響Fig 1A結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，不同濃度PA(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h時(shí)，細(xì)胞增殖率分別為97.99%、78.41%和57.72%。 與正常組比較，PA 0.2 、0.4 mmol·L-1組細(xì)胞增殖率均明顯下降(P<0.01)。Fig 1B結(jié)果表明，0.2 mmol·L-1PA刺激H9c2心肌細(xì)胞0、12、24、36、48 h時(shí)，高脂所致的心肌細(xì)胞增殖率為94.24%、85.76%、72.24%、50.72%，與正常組相比，呈現(xiàn)濃度依賴性下降趨勢(shì)。PA 0.2 mmol·L-1刺激心肌細(xì)胞36、48 h時(shí)，細(xì)胞增殖率出現(xiàn)50%以上的下降(P<0.01)，而36 h與48 h組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.2高脂刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響如Fig 2所示，與正常對(duì)照組比較，紅色熒光隨PA的濃度增大而減弱，而綠色熒光增強(qiáng)。在PA為0.4 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，形態(tài)出現(xiàn)明顯不規(guī)則現(xiàn)象，紅光變?nèi)?，而綠光變亮。由于線粒體在膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)內(nèi)，形成紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)內(nèi)，產(chǎn)生綠色熒光。結(jié)果表明，隨著PA的濃度逐漸增加，線粒體膜電位逐漸降低，并且細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

2.3高脂刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的影響如Fig 3所示，與正常對(duì)照組比較，PA濃度為0.2 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞中ROS水平有所增加，當(dāng)PA濃度為0.4 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞數(shù)量急劇減少，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均發(fā)生不同程度的改變，如細(xì)胞腫大、細(xì)胞核質(zhì)濃縮、細(xì)胞內(nèi)容物外溢等現(xiàn)象。

A:Cell viability was significantly suppressed when PA concentration increased to 0.4 mmol·L-1; B:Cell viability was significantly suppressed when incubated time exceeded 36 h and 48 h in 0.2 mmol·L-1PA.**P<0.01vscontrol (0 mmol·L-1PA).

Fig 2 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte mitochondrial membrane potential(×20)

2.4高脂刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig 4結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，PA濃度為0.1 mmol·L-1時(shí)AnnexinV-FITC標(biāo)記的綠色熒光明顯增強(qiáng)，PI標(biāo)記的紅色熒光在PA濃度為0.2 mmol·L-1時(shí)開始增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核均發(fā)生輕微形態(tài)學(xué)改變。在PA濃度為0.4 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變。

2.5高脂刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路的影響如Fig 5所示，與正常對(duì)照組相比，PA 0.4 mmol·L-1組Cyt-C和Cleaved casepase-3蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，而PA 0.1、0.2 mmol·L-1組與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。在PA刺激24 h的情況下，Bcl-2表達(dá)持續(xù)降低，PA 0.4 mmol·L-1組Bcl-2表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)，而Bax持續(xù)升高，在PA 0.4 mmol·L-1時(shí)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。Bcl-2、Bax在PA 0.1、0.2 mmol·L-1時(shí)與正常組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

3 討論

心肌病在臨床上分為原發(fā)性與繼發(fā)性，脂毒性心肌病屬于繼發(fā)性心肌病，由于心臟中脂質(zhì)大量積聚，機(jī)體對(duì)脂肪酸的攝取和利用遠(yuǎn)大于心肌細(xì)胞實(shí)際的氧化代謝需要，使心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量蓄積[8]，而蓄積的脂質(zhì)又對(duì)心肌產(chǎn)生毒性，造成心肌細(xì)胞損傷，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞脂代謝產(chǎn)物和介質(zhì)堆積。增加的脂肪酸也可以引起線粒體ROS產(chǎn)生過(guò)量，并且不能及時(shí)有效地清除，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和ATP生成減少，導(dǎo)致脂毒性心肌損傷[9]。因此，脂肪酸代謝紊亂是引起心肌細(xì)胞凋亡和功能障礙的重要原因之一。本研究結(jié)果顯示，H9c2心肌細(xì)胞在持續(xù)高脂環(huán)境刺激下，細(xì)胞存活率隨時(shí)間和濃度的增加逐漸下降，在PA濃度為0.4 mmol·L-1時(shí)，時(shí)間為24 h時(shí)極為明顯。PA 0.2 mmol·L-1時(shí)ROS明顯增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)異常，而PA 0.4 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞凋亡增加。說(shuō)明高濃度脂肪酸可使心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)目發(fā)生改變，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，影響心臟的正常功能。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

Fig 3 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte oxidative damage(×20)

Fig 4 Influence of PA-induced H9c2 cardiomyocyte apoptosis(×20)

Fig 5 Influence of palmitic acid concentration on expression of Cyt-C,Cleaved casepase-3,Bax and Bcl-2 in H9c2

*P<0.05vscontrol (0 mmol·L-1PA)

脂肪酸參與心肌病的病理過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，心肌細(xì)胞脂代謝紊亂，引起細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常，線粒體凋亡通路作為細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑，是近年來(lái)研究熱點(diǎn)之一[10]。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)化孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)在維持線粒體和細(xì)胞物質(zhì)信息交換方面起著重要作用，它通過(guò)節(jié)律性開放來(lái)保持膜內(nèi)外的離子梯度和電勢(shì)差，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡。凋亡刺激因素可以使MPTP由周期性開放變?yōu)槌掷m(xù)性開放，致使線粒體膜電位下降或消失、呼吸鏈功能破壞、形成細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)大分子通道，激活caspase-9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。此外，刺激因素也可通過(guò)降低線粒體的膜電位、改變線粒體膜磷脂等損傷線粒體[12]。本研究顯示，高脂刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h后，與正常組相比，JC-1綠色熒光增強(qiáng)，紅色熒光減弱，表明高脂導(dǎo)致線粒體膜電位下降，線粒體膜的完整性破壞，細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡，如細(xì)胞數(shù)目減少，失去正常形態(tài)，表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)改變，而且免疫印跡結(jié)果顯示線粒體凋亡蛋白Cyt-C、Cleaved caspase-3表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，高脂刺激H9c2心肌細(xì)胞能引起線粒體膜電位下降、相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)升高，從而促進(jìn)細(xì)胞損傷或凋亡。

Bcl-2家族中存在促凋亡因子(Bax)和抗凋亡因子(Bcl-2)，它們具有調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2大多位于線粒體外膜上，調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，具有抑制凋亡的作用。當(dāng)Bcl-2表達(dá)下降時(shí)，線粒體通透性增加，外膜孔徑變大，變大的線粒體孔徑導(dǎo)致線粒體中Cyt-C的釋放以及凋亡誘導(dǎo)因子增加。Bax是與Bcl-2共沉淀的X蛋白質(zhì)，Bax/Bcl-2比值增加，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，H9c2心肌細(xì)胞在高脂作用24 h后，Bax在PA 0.4 mmol·L-1時(shí)表達(dá)明顯升高，而Bcl-2降低，表明高脂刺激H9c2心肌細(xì)胞通過(guò)增加線粒體膜通透性來(lái)引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，高脂刺激H9c2心肌細(xì)胞能夠抑制細(xì)胞增殖，引起H9c2心肌細(xì)胞ROS水平的增加，線粒體膜電位的降低，最終誘發(fā)線粒體凋亡蛋白的表達(dá)。提示線粒體凋亡通路在高脂誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷中起重要的調(diào)控作用，進(jìn)而為理解脂毒性心肌損傷的形成機(jī)制提供了新的線索。然而，線粒體通路調(diào)控脂毒性心肌病的病理機(jī)制，以及是否還存在其他信號(hào)通路調(diào)控糖尿病心肌病線粒體凋亡通路，仍需進(jìn)一步闡明。