向曉雪，艾佳晨，趙 科，劉志壽，向菊芳，華曉萍，譚正懷

(1. 四川中醫(yī)藥高等專科學校藥學院，四川 綿陽 621000；2. 昆明科靈生物科技有限公司，云南 昆明 650000；3. 四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都 610041；4. 大竹縣人民醫(yī)院藥劑科，四川 達州 625100;5. 成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 610072；6. 四川大學藥學院，四川 成都 610014)

WHO發(fā)布的《2017年全球結核病報告》指出：據估算，2016年全球新發(fā)結核病患者約1 040萬例，與2015年一致[1]。目前，我國仍然是全球30個結核病高負擔國家之一，每年新發(fā)結核病患者約90萬例，位居全球第3位[2]。治療結核病需要多種抗結核藥物聯(lián)合使用半年以上，而這些藥物所致的主要毒性或不良反應是肝毒性，輕者為血清氨基轉移酶一過性升高，在療程中可自行恢復。重者則表現為食欲不佳、異常乏力或軟弱、惡心或嘔吐、深色尿、眼或皮膚黃染，嚴重者出現肝衰竭[3]。異煙肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampicin, RIF)、吡嗪酰胺、乙胺丁醇均可引起肝臟損害[4]。許多患者由于發(fā)生嚴重的肝臟毒性而不得不終止治療，反復多次終止治療常誘發(fā)結核桿菌的耐藥性，最終導致患者無藥可治而死亡[5]。

研發(fā)針對抗結核藥物所致肝損傷的治療藥物，是全球醫(yī)藥工作者所追求的主要目標。研究藥物的主要工具是動物模型，目前已經建立了RIF聯(lián)合INH致動物肝損傷模型[6-7]，但單獨使用RIF或INH復制肝損傷模型，以及INH和RIF聯(lián)合使用所致肝損傷3種動物模型的異同，INH與RIF合用對肝損傷的相互作用本質等問題，均未得到相關實驗佐證。為此，本文擬通過析因設計，探討INH、RIF單獨使用致肝損傷的特點，RIF、INH二藥在RIF聯(lián)合INH致肝損傷中的地位及相互作用。

1 材料

1.1藥物與試劑利福平膠囊(每粒0.15 g，批號：171102)、異煙肼片(每片0.1 g，批號：150901)，均為成都錦華藥業(yè)有限公司生產。臨用前，用0.5% CMC配成所需濃度的混懸液備用。直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL，貨號：CH0105004)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT，貨號：CH0105201)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST，貨號：CH0105202)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL，貨號：CH0105003) 測定試劑盒，均購自四川邁克生物科技股份有限公司。

1.2實驗動物昆明種(KM)小鼠，SPF級，♂，體質量(18～22) g，由四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)-2013-19。小鼠飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心屏障系統(tǒng)，合格證號：SYXK(川)-2013-100，室溫(22～25) ℃，濕度(50±5)%，明暗各12 h。

1.3儀器7020型全自動生化分析儀(日本株式會日立高新技術)。

2 方法

2.1分組與指標檢測

2.1.1單獨灌胃RIF 1次后不同時間對小鼠的影響 90只小鼠適應性喂養(yǎng)1 d后，按照體質量隨機分成對照組、RIF 100 mg·kg-14個時間點組、 RIF 300 mg·kg-14個時間點組，每組10只。分別灌胃RIF 100、300 mg·kg-1或等體積0.5% CMC-Na溶液。給藥后禁食不禁水,分別在給藥后2、4、8、12 h處理小鼠，稱體重，斷頭取血，用全自動生化儀測ALT、AST、TBIL、DBIL，取肝臟，計算肝指數。

2.1.2連續(xù)灌胃RIF、INH或RIF+INH對小鼠的影響 小鼠適應性喂養(yǎng)1 d后，采用析因設計，按照體質量隨機分成對照組、INH 150 mg·kg-1組、RIF 300 mg·kg-1組、RIF 150 mg·kg-1+INH 300 mg·kg-14個大組，每個大組又隨機再分為3個小組，即給藥1周、給藥2周、給藥3周組。每天灌胃給藥，連續(xù)給藥至預定時間點，禁食不禁水16 h后，取血清，測定其ALT、AST、TBIL， 取肝臟稱濕重，計算其臟器指數；取部分肝臟置于10%福爾馬林中固定后進行切片，HE染色。由病理學專家在顯微鏡下根據Tab 1的標準進行盲法評分。

3 結果

3.1灌胃RIF1次后小鼠血清轉氨酶活性不隨時間發(fā)生明顯變化由Tab 2可見，灌胃RIF 100 mg·kg-1或RIF 300 mg·kg-1后8 h內，小鼠血清ALT和AST活性均無明顯改變，于給藥后12 h血清轉氨酶活性有所降低，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，可能與給藥組禁食時間較長有關，無任何生物學意義。灌胃RIF 100 mg·kg-1或RIF 300 mg·kg-1后12 h內，小鼠總膽紅素和直接膽紅素均明顯升高，一直升高到給藥后12 h，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義。隨著給藥后禁食時間的延長，其肝臟指數逐漸減小，并在給藥后12 h與對照組比較有統(tǒng)計學差異，提示肝臟指數的改變可能與禁食時間密切相關，而與血中膽紅素水平的變化無明顯相關性。

3.2連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF1周對小鼠肝損傷相關指標的影響由Tab 3可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-11周，可明顯增加小鼠肝臟指數，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，但對其他指標無明顯影響，同時病理學檢查結果顯示(Fig 1)，小鼠肝臟無明顯損傷；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-11周，可明顯增加小鼠肝臟指數，升高ALT、AST及TBIL水平，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，同時病理學結果顯示(Fig 1)，小鼠肝細胞空泡形成明顯，且INH+RIF組病變更為嚴重，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3.3連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF2周對小鼠肝損傷相關指標的影響Tab 4、Fig 1結果顯示，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-12周，對小鼠肝臟組織有輕度損傷，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，對小鼠肝組織造成較重的損傷，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，與INH組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RIF組與INH+RIF組之間病變程度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

由Tab 4可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1、INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，均可明顯增加小鼠肝臟指數，升高小鼠血清AST、TBIL水平，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，均可明顯增加小鼠ALT血清水平，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義。Tab 5的析因方差分析結果顯示，在增加小鼠肝臟指數，升高小鼠血清ALT方面， INH和RIF均有明顯作用，在增加小鼠血清AST、TBIL水平方面，RIF發(fā)揮了主要作用；同時，除了在TBIL方面，INH和RIF無相互作用，其他方面均顯現出一定的相互拮抗作用，尤其是對肝臟指數及ALT的影響，INH和RIF聯(lián)用拮抗作用較為明顯。

3.4連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF3周對小鼠肝損傷相關指標的影響Tab 6、Fig 1結果顯示，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，對小鼠肝組織均可造成損傷，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義，且連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周較連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-13周引起的肝損傷更為嚴重，差異有統(tǒng)計學意義，但RIF組與RIF+INH組之間無明顯差異。

Tab 2 Effects on liver function index at different time after once-daily treatment of RIF in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig1EffectsofINH,RIForINH+RIFonliverhistopathologyinmiceatdifferenttime(HE×200) A: Control group; B: Administered INH for one week; C: Administered RIF for one week; D: Administered RIF+INH for one week; E: Administered INH for two weeks; F: Administered RIF for two weeks; G: Administered INH+RIF for two weeks; H: Administered INH for three weeks; I: Administered RIF for three weeks; J: Administered INH+RIF for three weeks.

Tab 3 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for one week in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsRIF group

Tab 4 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for two weeks in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 5 Liver index and hepatic biochemical index of factorial design AONVA in mice after successive medication for two weeks

由Tab 6可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，均可明顯增加小鼠肝臟指數；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，均可明顯升高小鼠血清ALT、TBIL水平；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-13周，可明顯增加小鼠AST水平，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義。Tab 7的析因方差分析結果顯示，RIF與INH聯(lián)用，RIF、INH在小鼠血清ALT水平升高中均發(fā)揮了作用；RIF對肝臟指數增加，AST、TBIL水平升高有明顯作用，而INH的作用不明顯；同時，結果顯示INH與RIF聯(lián)用過程中，對小鼠的肝指數，ALT、TBIL水平的影響均表現出明顯的相互拮抗作用。

4 討論

長期以來，人們普遍認同RIF對肝臟引起的損傷主要是膽汁淤積所致，但其是否對肝細胞有直接損傷未見報道。本研究發(fā)現，單次灌胃RIF即可引起直接膽紅素和總膽紅素明顯升高，而對肝損傷相關指標如ALT、AST以及肝臟指數，均無明顯影響，證實了RIF對肝的損傷作用主要因為膽汁的間接作用，而對肝組織無明顯的直接損傷作用。同時，也有文獻認為RIF單獨使用對肝臟的毒性作用較小[8]，也有報道大鼠、小鼠單獨使用RIF均可表現明顯的肝臟毒性[9]。本研究發(fā)現，RIF在給藥1周后即出現明顯的肝臟毒性，隨著給藥時間的延長，其毒性作用逐漸增加，尤其以膽紅素和肝臟指數表現突出。

Tab 6 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for three weeks in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsINH group

Tab 7 Liver index and hepatic biochemical index of factorial design AONVA in mice after successive medication for three weeks

臨床上發(fā)現INH單獨使用對肝臟具有明顯的毒性作用，癥狀為黃疸，伴惡心、嘔吐、厭食等臨床表現[10]。有文獻報道[11]，大鼠單獨使用INH可引起明顯的肝損傷；但也有學者將介導異煙肼肝毒性的代謝產物肼和乙酰肼對小鼠進行染毒，染毒劑量設置為100 mg·kg-1，結果并未發(fā)現明顯的藥物性肝損傷[12]。本研究發(fā)現，單獨使用INH 150 mg·kg-1(相當于臨床人用量的60倍)對小鼠僅有輕度肝損傷，這種損傷主要發(fā)生在連續(xù)給藥后2～3周，且僅表現在組織上，其轉氨酶及總膽紅素的變化并不大。

INH、RIF的聯(lián)合干預通常作為針對結核桿菌的一線治療方式，其常見的不良反應為藥物性肝損傷[13]。亦有資料顯示，無論大鼠或小鼠聯(lián)合應用INH和RIF，均可引起明顯的肝臟毒性作用[6-7]。INH、RIF聯(lián)用毒性增強的機制目前并未完全闡明，有人認為是肝藥酶之間的相互作用所致[14]，也有人認為是RIF通過細胞色素P450和孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)增加INH的代謝[15]。

目前，RIF是否能增加INH的肝毒性尚有爭議。有文獻指出，INH的肼類代謝產物為聯(lián)合化療時產生肝毒性的主要因素，RIF的肝微粒體酶誘導作用可增強INH的肝毒性，對膽紅素代謝產生競爭性抑制[14]。但也有研究以大鼠為實驗對象，發(fā)現RIF不會增加由INH誘導的DNA加合物的形成，不會增加INH誘導的肝臟CYP2E1的氧化作用[16]。本文研究發(fā)現，無論在肝臟指數、轉氨酶活性以及肝臟病理評分方面，INH均有明顯拮抗RIF肝臟毒性的作用，其機制可能與降低血液總膽紅素水平有關，詳細機制有待進一步探討。

由此可見，建立INH和RIF所致的小鼠肝損傷模型，若單獨采用INH灌胃給藥的方式建模，小鼠肝損傷程度較小，使用意義不大；單獨采用RIF或聯(lián)合INH對小鼠灌胃給藥，均可建立較成功的小鼠肝損傷模型。同時，本研究結果還提示，對于小鼠，在RIF與INH聯(lián)合使用時，其肝毒性主要來源于RIF，后者對肝臟毒性則主要因為膽汁淤積。因此有效解決膽汁淤積，可能是防治RIF聯(lián)合INH所致肝毒性的有效途徑之一。

(致謝：本實驗在四川省中醫(yī)藥科學院中藥藥理毒理研究所完成，在此對實驗過程給予指導和幫助的老師和同學們表示感謝！)