段曉梅，閆 爽，倪連麗，耿福能，劉 彬，劉 衡，張成桂，李 玥

(1. 大理大學(xué)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000；2. 藥用美洲大蠊四川省重點實驗室，四川 成都 610000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)與人體腸道菌群的組成和改變密切相關(guān)[1]。復(fù)方蜚蠊提取物PA、PB、PC[P4]中的君藥蜚蠊學(xué)名美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)，有促進組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫的作用[2-3]。本實驗研究復(fù)方蜚蠊提取物對慢性UC大鼠腸道菌群的影響。

1 材料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠96只，♀♂各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘)2016-0004，飼養(yǎng)于大理大學(xué)動物中心。

1.2儀器StepOne Plus RT-PCR型實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠)；InGenius型凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE公司)；NANODROP2000型核酸蛋白分析儀(Thermo公司)。

1.3藥物與試劑復(fù)方蜚蠊提取物(云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室提供)；糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)；SYBR Green I熒光定量PCR預(yù)混液UNG(含ROX)、DNA分子量標準Marker(GenStar)?？乖榛篬2]：取家兔結(jié)腸抗原，生理鹽水溶解后，加入等量完全弗氏佐劑制成。

1.4熒光定量PCR引物分別以硫酸鹽還原菌特有的功能酶基因序列，擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、大腸埃希菌種、腸球菌屬及總菌群的16S rDNA基因序列，設(shè)計菌種特異性PCR引物[3](Tab 1)，引物由上海生工生物工程公司合成。

Tab 1 PCR primer sequence of intestinal flora

2 方法

2.1動物模型的制備與給藥參照文獻[2]的方法造模，大鼠隨機分為正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine, SASP)組(300 mg·kg-1)、復(fù)方蜚蠊提取物PA、PB、PC高、中、低劑量組(200、100、50 mg·kg-1)，正常組和模型組灌腸給予生理鹽水2.5 mL·kg-1，其余各組灌腸給予相應(yīng)藥物(2.5 mL·kg-1)，每日給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

Tab 2 Quantitative results of intestinal flora (lg of copies, n=8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsSASP

2.2糞便采集與病理學(xué)觀察末次給藥后24 h，收集結(jié)腸糞便。HE染色制作結(jié)腸病理切片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.3糞便DNA的提取所有糞便采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取，按照說明書操作。

2.4標準曲線的制作復(fù)蘇、擴增菌液，提取質(zhì)粒作為PCR的標準品，用核酸蛋白分析儀檢測260 nm波長下的OD值及濃度，用于制作標準曲線。

2.5實時熒光定量PCR反應(yīng)將待測糞便樣本中提取的DNA進行PCR反應(yīng)。根據(jù)熔解曲線，分析PCR產(chǎn)物的特異性，并由StepOne Plus PCR儀分析定量結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1結(jié)腸黏膜病理學(xué)觀察在顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織病理切片，可見正常組大鼠結(jié)腸的結(jié)構(gòu)完整清晰；造模組大鼠結(jié)腸黏膜上皮出現(xiàn)破損、杯狀細胞大量丟失，黏膜層炎性細胞浸潤，提示造模成功。

3.2糞便細菌的定量結(jié)果每個糞便DNA樣本所含細菌拷貝濃度可通過標準曲線比較得到，由PCR儀得出定量結(jié)果(Tab 2)，各組大鼠糞便樣本總菌群數(shù)量差異無顯著性；與正常組相比，UC模型組雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量明顯減少(P<0.05)，大腸埃希菌、腸球菌與硫酸鹽還原菌數(shù)量有增加趨勢。

4 討論

腸道菌群對于維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用，腸道中菌群發(fā)生紊亂，容易導(dǎo)致很多腸道炎癥性疾病發(fā)生[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方蜚蠊提取物PA、PB、PC作用于UC大鼠可使腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量有不同程度增加，而PA、PC作用于UC大鼠可使具有條件致病性的大腸埃希菌、腸球菌、硫酸鹽還原菌數(shù)量有不同程度減少，提示復(fù)方蜚蠊提取物對調(diào)節(jié)腸道菌群具有一定作用，對維持腸道黏膜的平衡有一定的意義。本研究建立了穩(wěn)定的UC大鼠模型及合適的腸道微生態(tài)干預(yù)藥物評價指標，為UC治療藥物的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

(致謝：本實驗在大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)科技創(chuàng)新平臺完成，感謝對實驗給予幫助的老師和同學(xué)！)