黃平，竇長武，鞠海濤，王宏偉，肖瑞，牛麗麗

0 引言

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，原發(fā)于神經(jīng)上皮細胞，約占顱內(nèi)腫瘤的40%～50%[1]，腦膠質(zhì)瘤具有廣泛的侵襲性，其惡性程度高，發(fā)病機制尚不清楚，手術(shù)難以徹底切除，且生長速度快，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activators of transcription, STAT）是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，激活后可以轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與特異性DNA結(jié)合[2]，從多個方面調(diào)節(jié)細胞的生長、存活、分化和凋亡。STAT1是該家族的重要成員之一，在腫瘤形成過程中包括細胞周期進展、細胞凋亡、腫瘤血管生成以及腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用，但該基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及如何調(diào)控并作用于神經(jīng)上皮組織，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)的報道。本研究探討STAT1與相關(guān)蛋白P53、P21、bcl-2、Caspase-8的相關(guān)性和變化趨勢，進一步探討STAT1對膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞周期的影響及可能的機制，為膠質(zhì)瘤治療的新策略提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人腦膠質(zhì)瘤U251細胞由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)實驗室提供，在含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃，實驗時取對數(shù)生長期細胞。

1.2 主要試劑與儀器

pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鞠海濤博士惠贈），DMEM/F-12(1:1)細胞培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25% 胰酶（美國Gibco公司），LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司），SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），STAT1 p84/p91多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），P53、P21抗體（美國Santa Cruz公司），bcl-2、Caspase-8抗體（Abcam公司），人抗鼠IgG（H+L）（美國LI-COR公司）；熒光顯微鏡（中國Nikon公司），Western blot紅外熒光掃描系統(tǒng)（奧德賽CLX），Thermo酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明，制備LipofectamineTM2000復(fù)合物：每孔240 μl無血清無雙抗培養(yǎng)基+10 μl LipofectamineTM2000（總體積250 μl），室溫孵育5 min；DNA復(fù)合物：每孔246 μl 無血清無雙抗培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度為1.0 μg/μl），總體積250 μl；將兩個復(fù)合物混合制成DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物，室溫靜置20 min；將6孔板中的細胞用無血清無雙抗的培養(yǎng)基清洗細胞2次，加入2 ml無血清培養(yǎng)基；將復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖動6孔板，使其混勻，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中保溫6 h后，更換含血清無雙抗的培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進行下一步檢測。將細胞分為Mock組（無轉(zhuǎn)染）、空載組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1）和STAT1組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1）。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性

轉(zhuǎn)染前一天，細胞換液，胰酶消化，計數(shù)，以1×105個/孔接種于96孔板中，每孔加入含血清無雙抗的DMEM 200 μl，設(shè)置調(diào)零組和對照組，每組10個復(fù)孔，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；每孔加入1 μg/μl質(zhì)粒0.2 μl，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑0.5 μl；分別在轉(zhuǎn)染24、48 h后向每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)；4 h后終止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，低速振蕩10 min，充分溶解MTT試劑；酶聯(lián)免疫儀上選擇490 nm波長測定吸光度值，并計算10個復(fù)孔的平均值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數(shù)期細胞，倒去培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化細胞，用完全培養(yǎng)液輕輕吹打，1 000 r/min，離心5 min去上清液；加入4 ml PBS重懸細胞，吹打均勻后，再次1 000 r/min，離心5 min去上清液；加入1.2 ml PBS重懸細胞后，再加入2.8 ml 70%（預(yù)冷）乙醇中，輕輕吹打均勻，封口膜封口。4℃固定過夜（可長至2周）。1 000 r/min，5 min收集固定細胞，加入4 ml PBS重懸細胞，輕輕吹打均勻后，再次1 000 r/min，離心5 min去上清液；用0.4 ml PBS重懸細胞，輕輕吹打（防止細胞破碎）；加RNase-A約3 μl至終濃度約為50 μg/ml，37℃水浴消化30 min；加PI約50 μl（此時終濃度為65 μg/ml），避光染色30 min。尼龍網(wǎng)過濾，上機檢測。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移

在6孔板背后劃橫線做標(biāo)記，線與線間隔約1 cm，在每孔中加入約5×105個細胞；細胞貼壁后，槍頭劃痕，PBS清洗細胞3次，加入無血清無雙抗培養(yǎng)基；然后進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染4～6 h后更換無血清無雙抗培養(yǎng)基，并放入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0和24 h后取出拍照。

1.7 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組U251細胞中細胞周期相關(guān)蛋白P53、P21的表達情況

按照蛋白提取試劑盒說明，提取轉(zhuǎn)染48 h后細胞的總蛋白，利用BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸制備蛋白樣品。配置10%的分離膠，5%濃縮膠，膠凝固后進行上樣，上樣時應(yīng)保證每孔蛋白量一致，濃縮膠電泳時間30～40 min，電壓為90 V，分離膠電泳時間為60～90 min，電壓為160 V，電泳至溴酚藍到達玻璃板下緣時終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜，將膜放入平皿中（蛋白面朝上），倒入之前配好的封閉液，室溫下脫色，搖床上搖動封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜2次，10分鐘/次，加入熒光二抗常溫孵育1 h，TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min。將PVDF膜進行掃描，拍照并記錄。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以（±s）表示，對數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細胞

倒置相差顯微鏡下可見，Mock組轉(zhuǎn)染48 h后細胞生長狀態(tài)良好、形態(tài)均勻、細胞增殖旺盛且折光性好；與Mock組相比，空載組有少量細胞碎片及死細胞漂浮，但細胞生長狀態(tài)無明顯差異；與Mock及空載組相比，STAT1組培養(yǎng)液中可見較多死細胞漂浮及細胞碎片，貼壁細胞數(shù)量明顯減少，且生長緩慢，形態(tài)不規(guī)則，伸長或皺縮，折光性較差，見圖1。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，STAT1組可見較多綠色熒光蛋白表達，見圖2。

2.2 Western blot檢測pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后STAT1蛋白表達情況

空載和pcDNA3.1-STAT1分別轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細胞48 h后，Western blot法檢測各組STAT1蛋白表達，結(jié)果顯示，與Mock組、空載組相比較，STAT1組的STAT1蛋白表達量明顯增高（1.26±0.25），差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.043），而Mock組和空載組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1、圖3。

2.3 MTT比色法檢測pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染U251細胞后細胞增殖活性

將轉(zhuǎn)染的腦膠質(zhì)瘤U251細胞培養(yǎng)48 h后，用MTT法檢測各組的細胞增殖活性，以檢測高表達的STAT1對U251細胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，三組差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見表2。說明轉(zhuǎn)染STAT1后明顯的抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖。

表1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后膠質(zhì)瘤U251細胞STAT1蛋白的表達Table1 Expression of STAT1 protein in glioma U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表2 各組各時間點腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖活性測定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

表2 各組各時間點腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖活性測定 (±s)Table2 Proliferation activity of glioma U251 cells at different time points in each group (±s)

Notes: *: P＜0.05, compared with Mock group; #: P＜0.05, compared with Mock group and Empty vector group, respectively

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2.4 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對U251細胞周期的影響

PI染色檢測STAT1轉(zhuǎn)染U251細胞48 h后時的細胞周期情況，結(jié)果顯示：與Mock及空載組相比，STAT1組G0/G1期細胞比例明顯升高，S期比例明顯下降，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006;P=0.033）。結(jié)果顯示，STAT1可抑制腦膠質(zhì)瘤U251細胞的DNA合成及有絲分裂，導(dǎo)致細胞阻滯在G0/G1期，見表3、圖4。

2.5 細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對膠質(zhì)瘤U251細胞遷移能力的影響

圖1 轉(zhuǎn)染48 h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的生長情況 (×200)Figure1 Growth of glioma U251 cells observed under inverted phase contrast microscope 48 h after transfection (×200)

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染情況 (×200)Figure2 Glioma U251 cells observed under fluorescence microscopy 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (×200)

表3 轉(zhuǎn)染48h后STAT1對腦膠質(zhì)瘤U251細胞周期的影響Table3 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

結(jié)果顯示，24 h后Mock組細胞就已經(jīng)遷移越過劃痕范圍，空載組遷移能力較Mock組細胞略差，而STAT1組進入空白處的細胞明顯減少，細胞遷移能力受到抑制，見表4、圖5。結(jié)果表明STAT1的高表達抑制了腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力（P=0.001）。

2.6 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后各組U251細胞中P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表達情況

空載質(zhì)粒和pcDNA3.1-STAT1分別轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細胞48 h后，Western blot檢測各組蛋白表達。STAT1組與Mock和空載組相比，P53、P21、Caspase-8表達明顯增強，bcl-2表達明顯減弱，STAT1組與Mock組和空載組相比均有顯著差異（均P＜0.05）；而上述蛋白表達在空載組和Mock組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5、圖6～7。

圖3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1 48h后STAT1在U251細胞中的表達Figure3 Expression of STAT1 in U251 cells 48h after transfection with pcDNA3.1-STAT1

表4 細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1 24h后對膠質(zhì)瘤U251細胞遷移能力的影響Table4 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 for 24h detected by wound healing assay

圖4 轉(zhuǎn)染48h后STAT1對腦膠質(zhì)瘤U251細胞周期的影響Figure4 Effect of STAT1 on cell cycle of glioma U251 cells 48h after transfection

3 討論

膠質(zhì)母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最具有破壞性與侵略性的腫瘤[3]，約占膠質(zhì)瘤的50%左右[4]。近年來腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率呈年輕化趨勢，以青壯年為主要發(fā)病人群[5]。據(jù)統(tǒng)計，腦膠質(zhì)瘤患者手術(shù)后中位生存時間平均約12～18月，5年生存率＜10%[6]。近年來，隨著分子診斷概念的引入和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的推廣[7]，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后的生存率較前有所提高，但平均生存期仍然低于15月。隨著相關(guān)調(diào)控基因的發(fā)現(xiàn)與認識，基因治療開始進入包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的各種惡性腫瘤的研究領(lǐng)域，并且被認為是目前除手術(shù)、放療和化療以外的“第四模式”。

STAT是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，是細胞因子/生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中重要的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，激活后可以轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)與特異性的DNA結(jié)合，從多個方面調(diào)節(jié)細胞的生長、存活、分化和凋亡。STAT1是該家族的重要成員之一，它不僅可被細胞因子激活，也可被生長因子激活，比如表皮生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素和胰島素樣生長因子1（IGF-1）[8]。目前已知STAT1在多種腫瘤細胞中表達，如白血病[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等。STAT1在腫瘤形成過程中包括細胞周期進展、細胞凋亡、腫瘤血管生成以及腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用，并且已有相關(guān)研究證實STAT1基因在腫瘤細胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[12]，同時國內(nèi)學(xué)者已證實STAT1在腦膠質(zhì)瘤缺氧時起腫瘤抑制作用[13]。但該基因與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以及如何調(diào)控并作用于神經(jīng)上皮組織，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)的報道。

圖5 細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1后對膠質(zhì)瘤U251細胞遷移能力的影響Figure5 Migration ability of U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 detected by wound healing assay

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細胞中的表達 (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

表5 P53、P21、bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細胞中的表達 (±s)Table5 Expression of P53, P21, bcl-2 and Caspase-8 in U251 cells after transfection with pcDNA3.1-STAT1 (±s)

Note: *: P＜0.05, compared with Mock and Empty vector group,respectively

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圖6 P53、P21在轉(zhuǎn)染STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細胞中的表達Figure6 Expression of P53 and P21 in U251 cells after transfection with STAT1

圖7 bcl-2、Caspase-8在轉(zhuǎn)染STAT1腦膠質(zhì)瘤U251細胞中的表達Figure7 Expression of bcl-2 and caspase-8 in U251 cells after transfection with STAT1

在前期實驗中已證實，STAT1在膠質(zhì)瘤組織中低表達，而在正常腦組織中高表達[14-15]。本研究中，Western blot結(jié)果顯示在膠質(zhì)瘤U251細胞系中STAT1蛋白為高表達；MTT結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STAT1質(zhì)粒后，STAT1組U251細胞增殖明顯受到抑制。由此可知，LipofectamineTM2000成功將pcDNA3.1-STAT1導(dǎo)入U251細胞中，并且轉(zhuǎn)染后高表達的STAT1可抑制膠質(zhì)瘤U251細胞的生長。此外，細胞周期阻滯是導(dǎo)致細胞凋亡重要的原因。本研究流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示，與Mock組和空載組相比，腦膠質(zhì)瘤U251細胞系中高表達的STAT1可顯著抑制細胞周期進程，使細胞周期停滯在G0/G1期，從而促進細胞凋亡發(fā)生；因此，高表達的STAT1能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯，從而減弱膠質(zhì)瘤細胞體外的增殖能力；劃痕實驗發(fā)現(xiàn)在STAT1轉(zhuǎn)染24 h后，STAT1組遷移能力急劇下降。這一結(jié)果提示STAT1的高表達可直接抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力。

P53是一種抑癌基因，在惡性腫瘤中，有超過50%的該基因發(fā)生突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它控制著細胞周期的啟動，當(dāng)細胞缺乏P53基因時，即使在不利條件下，細胞仍可以繼續(xù)進行分裂。與所有其他的腫瘤抑制基因相同，P53基因可減慢正常細胞的分裂[16]。P21是CIP家族的成員，是位于P53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，它可以通過對細胞周期的作用，抑制某些細胞的有絲分裂活動，從而抑制細胞生長。P21可以和P53共同構(gòu)成細胞周期G1/S檢查站，參與細胞周期的調(diào)節(jié)[17]。有學(xué)者以siRNA-STAT1和pcDNA3.1-STAT1轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細胞，通過Western blot法檢測轉(zhuǎn)染細胞中P53、Cyclin E的表達水平，發(fā)現(xiàn)STAT1可以上調(diào)P53的表達，抑制Cyclin E的表達，從而導(dǎo)致了細胞周期阻滯、生長抑制和細胞凋亡[18]。

細胞周期阻滯涉及復(fù)雜的分子級聯(lián)反應(yīng)，各種基因的功能障礙可能導(dǎo)致細胞周期阻滯的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，STAT1抗腫瘤效應(yīng)是通過上調(diào)P53實現(xiàn)的[19]，而P53的上調(diào)又可以促進P21的表達[20]，使細胞周期阻滯于G1/S期，而細胞凋亡常發(fā)生于細胞周期的G1期，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡[21]。正常情況下細胞分裂周期進程的轉(zhuǎn)化由Cyclin-CDK（Cyclin-dependent kinase）復(fù)合物對細胞精確而嚴(yán)密的調(diào)控，例如CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2及其抑制劑（CKI）P21Cip1、P27Kip1的活性來動態(tài)調(diào)節(jié)細胞進程。研究表明，P53可誘導(dǎo)P21Waf1調(diào)控Cyclin E/CDK2和Cyclin A/CDK2復(fù)合物使RB磷酸化，P53和RB通路共同調(diào)控細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換，而腫瘤細胞中這兩條通路往往同時失調(diào)[22]。

B細胞淋巴瘤-2（bcl-2）家族蛋白被認為是程序性細胞死亡和凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在人類癌癥中具有突出作用[23]。根據(jù)其功能可分為兩類蛋白亞群[24]：一類為凋亡抑制蛋白（bcl-2、bcl-xL、bcl-xY等），是抗癌治療的主要靶點；另一類為凋亡促進蛋白（bax、bix、bad等）。所有bcl-2家族蛋白都具有共同的bcl-2同源（BH）結(jié)構(gòu)域。bcl-2蛋白能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中適宜的Ca2+濃度，使其保持動態(tài)平衡，避免線粒體中由于Ca2+濃度過高而引起細胞凋亡。此外，bcl-2還依靠抑制線粒體釋放細胞色素C來抑制細胞的凋亡，同時還可以抑制Smac/DIABLO的釋放[25]。Caspase-8是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中關(guān)鍵的啟動因子，細胞凋亡依賴一類對天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-8能夠通過寡聚而自身切割活化，并能激活下游半胱氨酸蛋白酶，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)[26]。

本實驗中，我們通過Western blot檢測了P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表達情況，結(jié)果表明，STAT1組的P53、P21、Caspase-8表達明顯增加，bcl-2表達明顯降低，其機制可能為STAT1可上調(diào)P53、P21、Caspase-8，下調(diào)bcl-2，使細胞周期阻滯于G0/G1期，而細胞凋亡常發(fā)生于細胞周期的G1期，從而導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡。這說明STAT1調(diào)控細胞增殖、凋亡作用是經(jīng)多分子信號途徑來實現(xiàn)的，這可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的機制之一，但此推測還需要大量的實驗進一步驗證和研究。