陳曉靜，王薇，周琛斐，魏文斐，吳湘光，嚴瑞明，張延梅，梁羅嬌，吳砂，梁莉，鐘梅，余艷紅

0 引言

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME）是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的微生態(tài)系統(tǒng)，其獨特的生物學(xué)特性對于腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)具有重要作用[1-2]。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages, TAMs）在腫瘤間質(zhì)中高度浸潤，是TME中的重要炎性細胞，與腫瘤進展、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。巨噬細胞在局部微環(huán)境的作用下獲得其獨特表型特征，根據(jù)其表型不同可分為殺傷腫瘤的經(jīng)典激活型巨噬細胞（M1）和促進腫瘤的替代激活型巨噬細胞（M2）[5]。M2型TAMs可通過上調(diào)腫瘤細胞促癌基因的表達，增強其侵襲轉(zhuǎn)移能力[6]。本研究觀察了M2型TAMs在宮頸癌進程中的分布情況，探索了M2型TAMs對宮頸癌細胞生物學(xué)行為的影響及其可能機制，為抑制TME促宮頸癌侵襲遷移提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 95例宮頸組織蠟塊樣本均來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科的組織樣本庫（2011—2013年），包含正常宮頸組織16例、宮頸上皮內(nèi)瘤變41例（19例CINⅠ、22例CINⅡ～Ⅲ）和宮頸鱗狀上皮細胞癌38例。

1.1.2 細胞系 人宮頸癌細胞系SiHa和C33a、人單核巨噬細胞系THP1均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。

1.1.3 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國Thermo Fisher Scientific公司），胎牛血清FBS（四季青，浙江天杭生物科技有限公司），抗CD163抗體（北京中杉金橋公司），抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體、抗Vimentin抗體、抗MMP-9抗體（美國Cell Signaling Technology公司），SP二步法試劑盒（北京中杉金橋公司），MMP-9引物合成（上海英濰捷基生物公司），超敏ECL發(fā)光液（北京Biosharp公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 組織芯片經(jīng)枸櫞酸鈉修復(fù)液（pH6.0）進行抗原修復(fù)（高壓修復(fù)，5 min），抗CD163抗體（濃度1∶800）4℃孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色液反應(yīng)2 min。

1.2.2 Western blot檢測 提取細胞總蛋白變性處理后，蛋白上樣量25 μg，用8%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離。一抗（E-cadherin 1:1 000; N-cadherin 1:1 000; Vimentin 1:1 000; MMP-9 1:500）4℃孵育過夜，二抗（濃度1:5 000）室溫孵育1 h，超敏ECL發(fā)光液顯色并拍照。

1.2.3 RT-qPCR檢測 提取總RNA，取2.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-qPCR擴增條件如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性5 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，40次循環(huán)。

1.2.4 劃痕實驗 將細胞按2×105個/孔接種于培養(yǎng)板，待細胞形成單層后，采用10 μl Tip滴頭在培養(yǎng)板呈直線形劃痕單層細胞，劃痕形成后采用磷酸鹽緩沖液 （PBS）沖洗2次，并記錄不同時間段（0 h、48 h）劃痕區(qū)域細胞的遷移情況。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 經(jīng)預(yù)處理的細胞消化，用無血清培養(yǎng)基DMEM重懸細胞，Transwell上室鋪有Matrigel膠并加入1×105個細胞，下室加800 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，8 h后取出小室，棉簽擦凈上室面的Matrigel膠及未穿透的細胞，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色20 min，流水洗滌5 min，正置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0軟件，組間數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析（one-way ANOVA）進行檢驗。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TAMs浸潤數(shù)目與宮頸病變程度呈正相關(guān)

利用不同病變程度的宮頸組織病理切片，以CD163標記M2型TAMs，結(jié)果顯示CD163主要表達于細胞間質(zhì)，其浸潤程度隨宮頸病變的進展而增加，見圖1；進一步分析CD163的表達強度與宮頸病變臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，CD163+TAMs在宮頸癌組織中的表達與FIGO分期（P=0.012）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.009）呈正相關(guān)，但與患者年齡、組織分化程度無關(guān)（均P＞0.05），見表1。以上結(jié)果提示CD163+TAMs與宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化和進展密切相關(guān)。

2.2 TAMs促進宮頸癌細胞侵襲和遷移

懸浮的人THP1單核細胞用佛波酯（PMA）處理后，增殖停止并貼壁，被誘導(dǎo)為未分化的巨噬細胞M0；再加入IL4和IL13，活化為M2型TAMs，CD163表達明顯增高，見圖2，用于后續(xù)研究。

實驗分為Blank、THP1-上清液（conditioned media, CM）和TAMs-CM刺激組。細胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細胞系SiHa和C33a形態(tài)發(fā)生顯著改變，見圖3。Blank和THP1-CM刺激組細胞為“立方形、邊緣圓鈍”的上皮細胞結(jié)構(gòu)，細胞間融合度高；TAMs-CM刺激宮頸癌細胞系SiHa和C33a呈現(xiàn)瘦長的間質(zhì)細胞樣改變，表現(xiàn)為“長梭形、偽足伸長、甚至出現(xiàn)單個細胞遷移，細胞間融合度降低”。

圖1 CD163在宮頸病變中的表達情況 (×200)Figure1 Expression of CD163 in cervical lesions (×200)

表1 CD163與宮頸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析Table1 Correlation of CD163 expression with clinicopathologic features of cervical cancer patients

劃痕實驗結(jié)果顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細胞系SiHa和C33a遷移能力較Blank、THP1-CM刺激組顯著增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023,P=0.015），見圖4A。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，TAMs-CM刺激后，宮頸癌細胞系SiHa和C33a的穿膜細胞數(shù)較Blank和THP1-CM刺激組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007,P=0.010），見圖4B，表明TAMs可顯著增強宮頸癌細胞的體外侵襲能力。

2.3 TAMs誘導(dǎo)宮頸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）

Western blot結(jié)果顯示，與Blank和THP1-CM刺激組相比，TAMs-CM組SiHa和C33a細胞上皮標志蛋白E-Cadherin的表達下調(diào)，間質(zhì)標志蛋白N-Cadherin和Vimentin的表達上調(diào)，見圖5，提示TAMs可誘導(dǎo)宮頸癌細胞發(fā)生EMT。

2.4 TAMs對宮頸癌細胞系MMP-9的表達調(diào)控作用

利用Western blot及RT-qPCR分別檢測不同條件巨噬細胞對宮頸癌細胞系SiHa和C33a的MMP-9蛋白和RNA表達水平的影響，結(jié)果提示TAMs-CM作用于SiHa和C33a宮頸癌細胞系后，MMP-9顯著上調(diào)，與對照組THP1-CM相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖6A。RNA水平的檢測也得到一致的結(jié)果，見圖6B。提示TAMs促進宮頸癌細胞的惡性變可能是通過上調(diào)MMP-9的表達實現(xiàn)的。

圖2 免疫細胞化學(xué)法(ICC)檢測不同激活狀態(tài)的巨噬細胞CD163的表達Figure2 Immunocytochemistry(ICC) detection of CD163 expression in macrophages with different activation states

圖3 Blank、THP1-CM和TAMs-CM刺激組中SiHa和C33a細胞的形態(tài)學(xué)改變Figure3 Morphological changes of SiHa and C33a cells in Blank, THP1-CM and TAMs-CM stimulation groups

圖4 劃痕(A)及Transwell(B)實驗檢測TAMs對宮頸癌細胞株SiHa遷移和侵襲行為的影響Figure4 Effect of TAMs on migration and invasion of cervical cancer SiHa cell lines detected by scratch(A) and Transwell(B) assays

圖5 TAMs對宮頸癌細胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響Figure5 Effect of TAMs on EMT of cervical cancer cell lines

3 討論

炎性反應(yīng)微環(huán)境在腫瘤的進展中發(fā)揮著重要作用，巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中浸潤性炎性細胞的主要成分。研究表明，TAMs與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在直接關(guān)系[3,6-7]。本研究結(jié)果提示，組織中CD163+TAMs浸潤程度隨著宮頸癌變病程進展而明顯增高，并與宮頸癌FIGO分期及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生呈明顯正相關(guān)，提示TAMs浸潤增多及其伴隨的炎性反應(yīng)微環(huán)境加重可能參與宮頸癌病變的發(fā)生發(fā)展?？梢?，M2型TAMs在腫瘤組織中的募集提示宮頸癌的不良預(yù)后。因此，研究TAMs影響宮頸癌細胞的作用機制并作出針對性干預(yù)對于指導(dǎo)宮頸癌臨床預(yù)后具有重要意義。

圖6 Western blot(A)和RT-qPCR(B)實驗檢測TAMs對宮頸癌細胞系MMP-9表達的影響Figure6 Effect of TAMs on MMP-9 expression in cervical cancer cell lines detected by Western blot(A) and RT-qPCR(B) assays

局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，其中EMT在該過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是惡性腫瘤獲得侵襲表型的重要步驟，并成為近年來的研究熱點[8-10]。研究表明，TAMs可分泌多種EMT相關(guān)細胞因子如TGF-β、CCL18、EGF等[11-12]。在口腔鱗癌中，TAMs可通過激活Gas6/Axl-NF-kB通路發(fā)揮促腫瘤作用并介導(dǎo)EMT的發(fā)生[13]。TAMs還能通過TGF-β和β-catenin通路介導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。本研究中，TAMs-CM刺激的宮頸癌細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變，胞體由“立方形、邊緣圓鈍”的形態(tài)變?yōu)殚L梭形，偽足不同程度增多且變得細長，細胞融合度降低，甚至出現(xiàn)單個細胞遷移，失去上皮細胞特性，顯示更多的間質(zhì)細胞樣特性，提示發(fā)生了一定程度的EMT。我們通過功能實驗驗證，發(fā)現(xiàn)TAMs-CM刺激組的長梭形宮頸癌細胞侵襲和遷移顯著增強，而且發(fā)生EMT表型變化，提示宮頸癌細胞發(fā)生形變后，細胞間黏附變差，侵襲轉(zhuǎn)移能力增強。由此我們推測TAMs可改變宮頸癌細胞的生物學(xué)行為，在宮頸癌進展中起著重要作用。

MMPs是一類高度保守的Zn2+依賴的內(nèi)源性蛋白水解酶家族，在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成過程中起重要作用[15]。MMP-9是MMPs家族最重要的成員，在癌細胞介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用，可破壞基底膜從而促進癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[16]。MMP-9在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞高表達，與不良預(yù)后密切相關(guān)[17-19]。有研究認為，MMP-9的表達是宮頸癌發(fā)生的早期事件[20-21]。另外，MMP-9在機體免疫調(diào)控中亦扮演重要角色。有研究證實MMP-9加強腫瘤免疫逃逸進而促進腫瘤進展[22]。有研究發(fā)現(xiàn)，高表達MMP-9的腫瘤細胞惡性程度更高[23]，與我們的研究結(jié)果相吻合。腫瘤細胞招募TAMs造成炎性反應(yīng)微環(huán)境，而招募的巨噬細胞又可促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，形成惡性循環(huán)[24]。TAMs-CM刺激后的宮頸癌細胞高表達MMP-9，且侵襲遷移能力顯著增強，進一步提示MMP-9可能作為中樞環(huán)節(jié)參與TAMs與腫瘤細胞之間的調(diào)控機制。

綜上所述，我們提出一個新的宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機制：TME中TAMs上調(diào)宮頸癌細胞MMP-9的表達，從而促進宮頸癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。靶向TME中TAMs及MMP-9的治療，將為宮頸癌的治療和預(yù)后提供新的指導(dǎo)依據(jù)與干預(yù)視角。