陳 琦，楊紅霞，李 雁，王曉喜，魏立新，杜玉枝*

1中國科學(xué)院西北高原生物研究所 青海省藏藥藥理學(xué)與安全性評價研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810000；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

貧血是一種紅細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致組織缺氧的疾病，全球25%的人受其困擾，而且在亞洲人群的發(fā)病率最高[1]，由于其周期長，病情發(fā)展比較緩慢，沒有特異性的臨床癥狀，具有極大的隱藏性，對人們的身體健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，它對兒童的認(rèn)知和運(yùn)動發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致普通人群的疲勞和低生產(chǎn)力[2]。

牦牛作為高原特有的牛種，由牦牛的鮮皮經(jīng)一系列加工制成的皮膠含有豐富的營養(yǎng)成分[3]，已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)牦牛皮膠含有20.95%人體必須氨基酸及鈣、鈉、鎂、鉀等礦物質(zhì)元素[4]。而牛皮膠的功效早在《本草綱目》中就有記載——“主治吐血，衄血，下血，血淋，下痢，妊婦胎動血下”，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)牦牛皮膠對人體的營養(yǎng)性貧血有改善的作用[5]。由環(huán)磷酰胺造成的再生障礙性貧血小鼠模型[6]穩(wěn)定可靠，可作為進(jìn)一步觀察牦牛皮膠的補(bǔ)血功效的疾病模型。觀察牦牛皮膠對貧血小鼠臟器系數(shù)、血象紅系參數(shù)及脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)等的影響，為探討牦牛皮膠的補(bǔ)血機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：17090125)；牦牛皮：購自青海西寧友誼屠宰場；彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；甲叉雙丙烯酰胺(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；過硫酸銨(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；TEMED(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；SDS(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；考馬斯亮藍(lán)G250(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；阿膠補(bǔ)血顆粒(東阿阿膠股份有限公司，產(chǎn)品批號：1711003)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級KM小鼠210只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，雌雄各半，所有小鼠在體質(zhì)量與周齡方面無明顯差異，具有可比性；購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：SYXK(甘)2015-0001。

1.3 儀器

電泳儀(BIORAD公司，PowerPac)；垂直電泳槽(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；Mini-PROTEAN Tetra)；凝膠成像儀(BIORAD公司，GelDoc 2000)；血液細(xì)胞分析儀(HORIBA公司，ABX Pentra XL80)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，AL105)；超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司，UPH-I-40L)；光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，BX41)；脫水機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司，TSJ-Ⅲ)；包埋機(jī)(常州市中威電子儀器有限公司，BMJ-Ⅲ)；切片機(jī)(Leica公司，RM2126)。

2 方法

2.1 供試藥物的制備

新鮮牦牛皮脫毛脫脂處理后，與蒸餾水以1:10(w/v)的比例，在80 ℃下連續(xù)加熱攪拌6 h，重復(fù)2次，將得到的明膠液體合并，加熱濃縮干燥得到牦牛皮膠干粉，其中每1 kg新鮮牦牛皮可得167 g牦牛皮膠干粉。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，用蒸餾水溶解牦牛皮膠干粉，分別配制成0.05、0.1、0.15、0.3 g/mL的牦牛皮膠溶液待用。

2.2 SDS-PAGE分析

依照Laemmli等[7]的方法，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%，樣品上樣量為5 μL。恒壓電泳，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。電泳結(jié)束后進(jìn)行染色，脫色，最后用凝膠成像儀進(jìn)行成像。

2.3 動物分組

SPF級小鼠210只，雌雄各半，隨機(jī)分成7組，按中藥學(xué)藥理學(xué)研究方法計(jì)算給藥劑量[8]，即空白對照組，模型對照組，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組，阿膠補(bǔ)血顆粒14.05 g/(kg·d)給藥組，每組30只。

2.4 貧血動物模型的建立[8-10]

采用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法建立貧血模型，除空白對照組外，其余各組經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺80 mg/kg，每日一次，連續(xù)4天?？瞻讓φ战M腹腔注射等量的生理鹽水。

2.5 給藥劑量與方法

于實(shí)驗(yàn)的第5天開始給予受試藥物，分別為牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥，阿膠補(bǔ)血顆粒14.05 g/(kg·d)給藥；各給藥組分別連續(xù)給藥7、14、21天，分別于三個時間點(diǎn)末次給藥30 min后，每組各取10只進(jìn)行眼球后靜脈叢取血，血液細(xì)胞分析儀分析外周血象紅系參數(shù)；稱取體質(zhì)量，頸椎脫臼處死后，解剖取出脾臟和胸腺，剝離周圍脂肪組織、結(jié)締組織，并用濾紙吸去其表面附著的血液，使用精密電子天平稱取脾臟和胸腺的質(zhì)量，按臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量公式計(jì)算脾臟和胸腺系數(shù)；取小鼠脾臟，置于4%多聚甲醛中固定、再經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(約6 μm)、HE染色制作石蠟切片，顯微鏡下觀察脾臟組織結(jié)構(gòu)[11]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x ± s )表示，選用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)方法判斷結(jié)果的顯著性，P﹤0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 牦牛皮膠的分子量分布

由于不同分子量的牦牛皮膠理化性質(zhì)[12]不同，因此對供試的牦牛皮膠進(jìn)行了SDS-PAGE分析，圖1結(jié)果顯示了牦牛皮明膠在10～180 kD的分子量范圍的SDS-PAGE圖譜，可看出被試藥物分子量分布廣泛，在17～180 kD的范圍內(nèi)均有分布。

圖1 牦牛皮明膠的SDS-PAGE圖譜 Fig.1 SDS-PAGE pattern of yak skin gelatin M.Molecular weight marker注：M.分子量標(biāo)記物；A.牦牛皮膠樣品。Note:A.gelatin extracted from the Yak skin.

3.2 牦牛皮膠對貧血小鼠一般體征的影響

空白對照組小鼠整個實(shí)驗(yàn)過程中皮毛光滑，飲食狀況良好，鼻唇顏色淡粉紅；造模的第三天起，除空白對照組外各組小鼠的進(jìn)食量減少，毛蓬豎而且少光澤，耳、眼、尾及四肢的顏色蒼白；給予牦牛皮膠和阿膠顆粒后各組小鼠的狀況均有改善，逐漸接近空白對照組。

3.3 牦牛皮膠對貧血小鼠臟器系數(shù)的影響

表1結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組脾臟系數(shù)顯著升高(P<0.05)，提示小鼠在注射環(huán)磷酰胺后免疫抑制，脾臟代償性造血，脾臟體積增大[13]，因而脾臟系數(shù)增大，說明造模成功。與模型組相比，給藥7天，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組、2 g/(kg·d)給藥組、3 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；給藥14天，牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)；給藥21天，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組脾臟系數(shù)顯著降低(P<0.05)，說明各濃度牦牛皮膠均能減輕免疫抑制造成的脾臟代償性造血的狀況，且在給藥7天時效果最優(yōu)。

與空白對照組相比，模型組胸腺系數(shù)顯著降低(P<0.05)，提示各組小鼠胸腺萎縮，免疫功能下降，造模成功；與模型組相比，給藥7天，牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)；給藥14天，牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)；給藥21天，牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組、 2 g/(kg·d)給藥組和阿膠補(bǔ)血顆粒組胸腺系數(shù)均顯著升高(P<0.05)，表明各組牦牛皮膠均能使得環(huán)磷酰胺造成的免疫功能降低的狀況好轉(zhuǎn)，且隨給藥時間的延長效果越顯著。

表1 牦牛皮膠對貧血小鼠臟器系數(shù)的影響

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

3.4 牦牛皮膠對貧血小鼠外周血象紅系參數(shù)的影響

表2及表3結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度顯著降低(P<0.05)，說明環(huán)磷酰胺造模使小鼠的造血功能抑制，模型建立成功。

與模型組相比，給藥7天，1 g/(kg·d)給藥組，血紅蛋白、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.01)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.01)；給藥14 d，1 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容及平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組和3 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)；給藥21 d，1 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及紅細(xì)胞比容顯著升高(P<0.05)，2 g/(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，3 g /(kg·d)給藥組，紅細(xì)胞數(shù)及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)，6 g/(kg·d)給藥組，平均血紅蛋白量顯著升高(P<0.05)，阿膠補(bǔ)血顆粒組，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度顯著升高(P<0.05)。各給藥組的血象紅系參數(shù)相對模型組均有提高，其中以1 g/(kg·d)給藥組的效果最明顯，且在給藥14天各給藥組作用明顯。

表2 牦牛皮膠對貧血小鼠血象紅系參數(shù)的影響

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

表3 牦牛皮膠對貧血小鼠血象紅系參數(shù)的影響

續(xù)表3(Continued Tab.3)

組別Group平均血紅蛋白量MCH (pg)平均血紅蛋白濃度MCHC (g/L)7 d14 d21 d7 d14 d21 d1 g/(kg·d)給藥組1 g/(kg·d) medicated group15.38±0.51##15.27±0.60##14.70±0.23284.22±5.64##278.75±5.18283.00±8.102 g/(kg·d)給藥組2 g/(kg·d) medicated group15.49±0.50##15.45±0.78##15.16±0.48#279.25±9.69##285.75±4.83##287.00±10.38#牦牛皮膠給藥組Medicated group of yak skin gelatin3 g/(kg·d)給藥組3 g/(kg·d) medicated group14.78±0.9815.11±0.56#14.97±0.70270.50±7.45289.75±10.79##288.86±8.78#6 g/(kg·d)給藥組6 g/(kg·d)medicated group15.11±0.58##15.06±0.66#15.17±0.54#273.57±15.23285.00±9.01##281.17±11.43阿膠補(bǔ)血顆粒組Lvjiaobuxue granules group15.78±0.69##15.01±0.51#15.64±2.95#293.64±4.55##282.67±14.28#279.27±15.29

注：與空白組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比#P<0.05，##P<0.01。

Note:Compare with control,*P< 0.05;**P< 0.01;Compare with model,#P<0.05，##P<0.01.

3.5 牦牛皮膠對貧血小鼠脾臟結(jié)構(gòu)的影響

圖2和圖3結(jié)果顯示，空白對照組紅髓、白髓界限清楚，脾索內(nèi)有豐富的淋巴細(xì)胞，有較多的脾小體，脾竇無充血；模型組紅髓白髓界限不清，淋巴細(xì)胞數(shù)目和脾小體減少，脾竇充血；給藥14天，各給藥組可見白髓中淋巴細(xì)胞密集，巨噬細(xì)胞和巨核細(xì)胞明顯增多，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血；給藥21天，各給藥組可見較多的淋巴細(xì)胞，白髓與紅髓的界限變清晰。

圖2 貧血小鼠給藥14天脾臟HE染色結(jié)果(400×) Fig.2 Results of HE staining of mice with cyclophosphamide-induced anemia for 14 days (400×) 注：A.空白對照組；B.模型組；C.牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組；D.牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組；E.牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組；F.牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組。Note:A.Control group;B.Model group;C.1 g/(kg·d) medicated group;D.2 g/(kg·d) medicated group;E.3 g/(kg·d) medicated group；F.6 g/(kg·d) medicated group.

4 討論

現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)動物皮膠有滋陰補(bǔ)血的功效[14]，牦牛皮膠由于它豐富的營養(yǎng)價值，已經(jīng)作為生物制品用于臨床，本實(shí)驗(yàn)針對環(huán)磷酰胺所致的貧血小鼠的血象紅系參數(shù)、臟器系數(shù)和脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)研究了牦牛皮膠的補(bǔ)血作用。

圖3 貧血小鼠給藥21天脾臟HE染色結(jié)果(400×)Fig.3 Results of HE staining of mice with cyclophosphamide-induced anemia for 21 days (400×) 注：A.空白對照組；B.模型組；C.牦牛皮膠1 g/(kg·d)給藥組；D.牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組；E.牦牛皮膠3 g/(kg·d)給藥組；F.牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組。Note:A.Control group;B.Model group;C.1 g/(kg·d) medicated group;D.2 g/(kg·d) medicated group;E.3 g/(kg·d) medicated group；F.6 g/(kg·d) medicated group.

環(huán)磷酰胺作為一種細(xì)胞烷化劑，對骨髓細(xì)胞有損傷的作用，引起骨髓造血功能降低，進(jìn)而導(dǎo)致血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等功能成分的降低，造成貧血，同時，環(huán)磷酰胺也是一種免疫抑制劑，對機(jī)體的免疫器官有損傷的作用[15,16]；本研究的實(shí)驗(yàn)過程中，隨著環(huán)磷酰胺給藥時間的增加，小鼠精神萎靡，行動遲緩，毛發(fā)脫落且沒有光澤，進(jìn)食減少，體重下降，脾臟系數(shù)增高，胸腺系數(shù)下降，血象紅系參數(shù)中紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度均顯著降低，脾臟的正常組織形態(tài)被破壞，脾淋巴細(xì)胞減少，所有特征符合環(huán)磷酰胺致貧血模型的動物特征。

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、發(fā)育和成熟的場所，其系數(shù)的變化能體現(xiàn)機(jī)體免疫機(jī)能的變化[17]，給藥組小鼠胸腺系數(shù)的升高提示牦牛皮膠能逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺造成的胸腺萎縮的情況，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；同時由于免疫抑制的原因，骨髓造血功能受損，脾臟代償性髓外造血[18,19]，使脾臟的體積增大，脾臟系數(shù)升高，牦牛皮膠給藥后，脾臟系數(shù)的降低說明骨髓造血的功能有一定程度恢復(fù)，脾臟的代償性造血減少。其中除牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組外各給藥組在給藥7天時均能顯著降低胸腺系數(shù)，提示牦牛皮膠給藥短期內(nèi)能刺激小鼠的骨髓造血，減弱脾臟代償性造血。而隨給藥時間的延長，模型組與空白組差異逐漸減小，說明停用環(huán)磷酰胺后小鼠的骨髓造血自行開始恢復(fù)；給藥組與模型組差異逐漸變小，提示給藥周期延長后骨髓造血的恢復(fù)同小鼠自然恢復(fù)沒有差別。除牦牛皮膠6 g/(kg·d)給藥組外，其余各給藥組在給藥21天時均能顯著降低胸腺系數(shù)，提示牦牛皮膠增強(qiáng)免疫功能的作用需要較長的給藥時間，而隨給藥時間的延長，模型組與空白組差異逐漸減小，說明停用環(huán)磷酰胺后小鼠的免疫功能開始恢復(fù)，給藥組與空白組差異逐漸減小，提示牦牛皮膠給藥時間延長時能協(xié)同機(jī)體自然恢復(fù)增強(qiáng)免疫功能直至正常。其中牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組既能恢復(fù)免疫功能又能增強(qiáng)骨髓造血功能。

牦牛皮膠給藥后，各給藥組紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、平均血紅蛋白量及平均血紅蛋白濃度均有升高；隨給藥時間的延長，模型組與空白組差異減小，但仍有差異，說明停用環(huán)磷酰胺后小鼠造血功能逐漸自然恢復(fù)，給藥組與空白組差異逐漸減小，說明隨著牦牛皮膠給藥時間延長機(jī)體的造血功能也在逐步恢復(fù)；其中給藥14天時提高貧血小鼠血象紅系參數(shù)效果顯著，提示給藥14天補(bǔ)血效果最佳，可拮抗環(huán)磷酰胺的骨髓抑制功能。其中牦牛皮膠2 g/(kg·d)給藥組在給藥7、14、21天時均能升高各血象紅系參數(shù)，說明該濃度牦牛皮膠補(bǔ)血效果好且持久。

各組貧血小鼠給藥后脾臟組織形態(tài)逐漸恢復(fù)，紅髓和白髓的界限逐漸清晰，脾淋巴細(xì)胞增多，同時三個不同給藥濃度組隨給藥時間的延長，脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)均逐漸趨近正常，和脾臟系數(shù)結(jié)果相吻合，都提示牦牛皮膠恢復(fù)了機(jī)體的免疫功能。

機(jī)體的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)體系復(fù)雜，本研究觀察了牦牛皮膠在治療貧血過程中，對機(jī)體的脾臟及血象紅系參數(shù)的指標(biāo)影響，其結(jié)果可為進(jìn)一步研究其對免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的作用機(jī)制和作用方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。