鄧謝淑婷 劉興隆 周璇 袁竹 孫滋蔚 吳海燕

(1. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都 610041)

1 肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)的分類及其感染

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，Spn)是一種有莢膜的革蘭陽(yáng)性雙球菌，可按莢膜多糖組成成分的不同對(duì)其進(jìn)行血清型分型。截止至2013年，世界范圍內(nèi)已出現(xiàn)90多種不同的血清型，且其分布具有很強(qiáng)的地域性和時(shí)間性[1]。

肺炎鏈球菌感染可引起中耳炎、鼻竇炎等呼吸道粘膜疾病，若細(xì)菌入血可能會(huì)引起更嚴(yán)重的侵襲性肺炎球菌疾病(Invasive pneumococcal diseases，IPD)[2]，在發(fā)展中國(guó)家，每年大約有1450萬(wàn)嬰兒患有嚴(yán)重的肺炎球菌疾病，并在全球范圍內(nèi)造成了100多萬(wàn)人的死亡[3]。根據(jù)其感染的機(jī)制，人們不斷地開(kāi)發(fā)出得以應(yīng)對(duì)的治療方法。例如，肺炎鏈球菌在鼻咽部定植之前需與此處的常駐微生物群競(jìng)爭(zhēng)從而取得繁殖優(yōu)勢(shì)。有研究顯示，細(xì)胞因子白介素-17(IL-17)可以預(yù)防肺炎鏈球菌鼻腔定植的發(fā)生[4]，其抵抗肺炎鏈球菌定植的機(jī)制可能是由于它所驅(qū)動(dòng)的鼻腔微生物群組成的變化[5]，且它的保護(hù)作用依賴于細(xì)菌侵襲力和莢膜厚度：對(duì)于高侵襲性薄莢膜的肺炎鏈球菌，IL-17具有更強(qiáng)的保護(hù)作用[6]。總之，隨著更多研究的開(kāi)展，肺炎鏈球菌感染機(jī)制的研究得以不斷深入，為疾病的預(yù)防與治療提供了新思路。

2 傳統(tǒng)多糖疫苗

莢膜多糖疫苗是目前預(yù)防肺炎鏈球菌感染最主要應(yīng)用的疫苗，并且兒童和成人所接種的多糖疫苗種類不同，應(yīng)用于兒童的主要是7，10和13價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗(PCV-7，-10，-13)，而應(yīng)用于成人的是23價(jià)肺炎球菌純多糖疫苗(PPV-23)。但隨著大面積的投入使用，多糖疫苗顯示出了一定的局限性。除了其生產(chǎn)的高成本，無(wú)法誘導(dǎo)二次免疫應(yīng)答，有限的血清型覆蓋率[7]等原因之外，近期有地區(qū)監(jiān)測(cè)研究顯示，在引入PCV-13國(guó)家免疫計(jì)劃后，非疫苗血清型(Non-vaccinetypes，NVT)與其所致的侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)比例有所增高[8]，這對(duì)多糖疫苗的保護(hù)作用提出了更大的考驗(yàn)。總之，我們需要尋找新的疫苗，以便能對(duì)更廣泛的肺炎鏈球菌菌株提供更經(jīng)濟(jì)的防護(hù)。

3 新型疫苗的開(kāi)發(fā)

新型肺炎鏈球菌疫苗的研發(fā)需要考慮合適的疫苗抗原、佐劑和遞送載體。目前處于研究階段的新型疫苗抗原候選物主要為以下三種：蛋白質(zhì)疫苗、全細(xì)胞疫苗和DNA疫苗。

3.1 蛋白質(zhì)疫苗

由于在不同血清型菌種間較保守的結(jié)構(gòu)組成，蛋白質(zhì)抗原在肺炎鏈球菌疫苗中的應(yīng)用是人們?cè)谛乱呙玳_(kāi)發(fā)中重要的突破口。目前此種疫苗在研究中取得了較大進(jìn)展，在此我們主要討論以下三種：肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)、肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)和肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)。

3.1.1肺炎球菌溶血素

由于肺炎球菌溶血素(Pneumolysin，Ply)具有細(xì)胞毒性，不能以原型直接作為疫苗組成成分，需對(duì)其結(jié)構(gòu)中的某些氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行修飾，從而產(chǎn)生低毒性的衍生物，方可加入到疫苗中。變異的溶血素衍生物雖然毒性降低，但仍保留了原溶血素的免疫原性與免疫反應(yīng)性。最近，一項(xiàng)研究測(cè)定了一種溶血素衍生物在小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的T細(xì)胞表位(如表1)，并發(fā)現(xiàn)其與通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)出來(lái)的該衍生物在人體中的T細(xì)胞表位具有相當(dāng)大的重疊。如果小鼠中鑒定出的T細(xì)胞表位也可以在人體中得到證實(shí)，這些表位中具有一定序列的氨基酸將可作為新型疫苗的重要組成成分。

表1 溶血素衍生物PlyD1中的T細(xì)胞表位[9]

注：劃線部分為免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位，即引起最強(qiáng)的T細(xì)胞反應(yīng)；其余為亞優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位。

3.1.2肺炎球菌表面蛋白A

肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface proteinA，PspA)是一種膽堿結(jié)合表面蛋白，其干擾補(bǔ)體成分C3在肺炎球菌細(xì)胞表面的固定，從而抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，以促進(jìn)細(xì)菌的免疫逃避。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，PspA顯示出對(duì)肺炎鏈球菌所致的膿毒癥、肺炎的保護(hù)作用[10]。值得注意的是，PspA的N-末端區(qū)域由重復(fù)的α端螺旋結(jié)構(gòu)組成，其長(zhǎng)度和氨基酸序列可變，雖然針對(duì)此區(qū)域的抗體具有一定的交叉保護(hù)性，但當(dāng)疫苗所包含的PspA和攻擊菌株的PspA具有相同的α螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)，疫苗體現(xiàn)出最強(qiáng)的保護(hù)作用[11]，因此我們可以在疫苗開(kāi)發(fā)中加入一種以上的PspA，以增強(qiáng)疫苗的覆蓋率。

3.1.3肺炎球菌表面蛋白C

肺炎球菌表面蛋白C(Pneumococcal surface protein C，PspC)可促進(jìn)肺炎鏈球菌對(duì)鼻咽部上皮細(xì)胞的粘附，它的結(jié)構(gòu)中具有和PspA相似的PR區(qū)域，即蛋白質(zhì)N-末端和C-末端之間的一段富含脯氨酸的保守氨基酸序列，故針對(duì)PspC的抗體可以同時(shí)顯示出對(duì)PspA的交叉保護(hù)作用[12]。

值得注意的是，肺炎鏈球菌在正常情況下為鼻腔部的微生物共生體，完全消除定植于鼻腔部的全部肺炎鏈球菌是難以實(shí)現(xiàn)甚至是有害的，因此確定肺炎鏈球菌由正常共生體轉(zhuǎn)化為致病菌的定植量的界值是研究人員目前面對(duì)的挑戰(zhàn)；另外，肺炎鏈球菌與其他上呼吸道細(xì)菌和病毒以及共生菌群之間具有協(xié)同或拮抗相互作用[13]。例如，一些上呼吸道細(xì)菌和病毒的感染是使肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化為病原體的潛在因素，目前已有研究證明了流感病毒和肺炎鏈球菌 之間的協(xié)同作用[14]，因此對(duì)于一些沒(méi)有針對(duì)甲型流感常規(guī)免疫計(jì)劃的國(guó)家，其鼻咽部的微生物負(fù)擔(dān)增加，可能會(huì)影響疫苗的效力；另一方面，肺炎鏈球菌與鼻腔部中某些菌種之間具有拮抗關(guān)系。有研究顯示，肺炎鏈球菌定植的減少會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)金黃色葡萄球菌攜帶率的增加[15]，因此在引入肺炎鏈球菌蛋白疫苗前，我們需要考慮肺炎鏈球菌和與其具有拮抗關(guān)系菌種之間的平衡變化。此外，有研究顯示，在一些具有高肺炎鏈球菌細(xì)菌負(fù)荷的國(guó)家，疫苗可能難以體現(xiàn)出預(yù)期的保護(hù)作用，原因可能是長(zhǎng)期的高濃度抗原環(huán)境導(dǎo)致的CD4+T細(xì)胞功能的部分喪失進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞分化成抗體分泌細(xì)胞的過(guò)程[16]。因此，在未來(lái)蛋白質(zhì)疫苗的開(kāi)發(fā)與推廣過(guò)程中，我們需要考慮不同地區(qū)的免疫應(yīng)答因素。

3.2 全細(xì)胞疫苗

全細(xì)胞疫苗(Whole cell vaccine，WCV)也是有力的新疫苗開(kāi)發(fā)候選物[17]。將減毒或滅活的肺炎鏈球菌菌體整個(gè)注入到宿主體內(nèi)，為免疫協(xié)同應(yīng)答提供了多個(gè)作用靶點(diǎn)，并且其生產(chǎn)的低成本也為在發(fā)展中國(guó)家的推廣創(chuàng)造了條件。目前批準(zhǔn)應(yīng)用的全細(xì)胞疫苗主要為鋁佐劑肺炎球菌疫苗，其抗原為莢膜陰性的減毒肺炎球菌突變體，并通過(guò)加入氫氧化鋁以增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。對(duì)于此種疫苗，推薦使用注射給藥。目前美國(guó)正在進(jìn)行全細(xì)胞疫苗臨床試驗(yàn)的第一階段研究以探究其安全性與免疫原性。但是全細(xì)胞疫苗目前仍存在很多隱慮。首先，處理后的肺炎球菌所提供的抗原位點(diǎn)并不是均對(duì)免疫防御具有正性協(xié)同作用，有些特定組合的抗原可能會(huì)干擾疫苗的保護(hù)作用；其次，減毒菌株在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)為致病狀態(tài)的可能性仍令人擔(dān)憂；此外，由于疫苗的保護(hù)效力受到滅活方法、給藥途徑和免疫途徑等多因素的影響，因此我們?nèi)匀恍枰M(jìn)行更多的研究去探索其最佳的制造與應(yīng)用方法。

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗目前仍處于研究探索階段。一項(xiàng)研究顯示，將編碼攻擊菌株表面蛋白A的DNA序列注射至小鼠體內(nèi)，其誘導(dǎo)的保護(hù)作用的水平與直接注射純化蛋白質(zhì)所誘導(dǎo)的相似[18]，這為DNA抗原在疫苗開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。DNA疫苗易于制造、成本低、運(yùn)輸穩(wěn)定，這些特性使其成為在發(fā)展中國(guó)家推廣的理想選擇。但裸露的質(zhì)粒DNA僅誘導(dǎo)較弱的免疫應(yīng)答，這可能與其在粘膜表面的降解有關(guān)。因此為了構(gòu)建有效的DNA疫苗，我們需要選擇合適的DNA遞送系統(tǒng)。有研究顯示，殼聚糖作為天然可生物降解的多糖可與DNA分子絡(luò)合形成納米粒子，從而提高疫苗遞送的能力，增強(qiáng)其所誘發(fā)的免疫應(yīng)答反應(yīng)[19]，這為日后DNA疫苗的開(kāi)發(fā)在遞送系統(tǒng)的選擇上提供了啟示。

3.4 疫苗的其他組成成分

除了疫苗抗原外，佐劑也是疫苗中重要的組成成分，它是能夠改變或增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答、發(fā)揮輔助作用的一類物質(zhì)。選擇合適的佐劑是新疫苗開(kāi)發(fā)成功的關(guān)鍵。如將全細(xì)胞疫苗以鼻內(nèi)用藥方式作用于粘膜免疫時(shí)可以加入霍亂弧菌作為佐劑以增強(qiáng)其減少細(xì)菌鼻咽定植的保護(hù)作用。其增強(qiáng)粘膜免疫的機(jī)制可能與上呼吸道抗肺炎球菌粘膜分泌型IgA抗體的產(chǎn)生增加有關(guān)[20]。

此外，新疫苗的開(kāi)發(fā)還需要選擇合適的載體。例如，乳酸菌是我們生活中常用的一種細(xì)菌，有研究顯示，將可產(chǎn)生肺炎球菌毒力蛋白的重組乳酸菌注入到小鼠體內(nèi)時(shí)，可誘導(dǎo)血清中相關(guān)抗體的生成，并且作為益生菌，其對(duì)人體的健康傷害較小，體現(xiàn)了它作為疫苗遞送載體的巨大潛力[21]。

綜上所述，雖然目前針對(duì)新疫苗的開(kāi)發(fā)仍然存在許多未解決的問(wèn)題，但是不可否認(rèn)的是，新的疫苗的出現(xiàn)是符合當(dāng)今疫苗使用趨勢(shì)的。有研究顯示，對(duì)于未接種人群，不同血清型的肺炎鏈球菌所致疾病的發(fā)病率都遵循的幾乎相同的年齡變化分布曲線(見(jiàn)圖1)，說(shuō)明機(jī)體針對(duì)肺炎鏈球菌的免疫并不是血清依賴性的，可能存在一種共同的機(jī)制將各種血清型作為一個(gè)整體進(jìn)行免疫防御，這為開(kāi)發(fā)非血清依賴性的新疫苗提供生理學(xué)依據(jù)。

圖1 不同莢膜血清型引起的侵襲性肺炎球菌疾病的年齡特異性發(fā)病率[22]

在“超級(jí)細(xì)菌”勢(shì)頭迅猛的今天，肺炎鏈球菌對(duì)常規(guī)疫苗敏感性的下降令人擔(dān)憂。我們不得不在已有的預(yù)防方法基礎(chǔ)上探索新的便于生產(chǎn)、更為高效的疫苗。幸運(yùn)的是，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和高通量全基因組測(cè)序等多種新興測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為我們?cè)诜肿铀缴险J(rèn)識(shí)和應(yīng)對(duì)肺炎鏈球菌提供了巨大幫助。

蛋白質(zhì)疫苗、全細(xì)胞疫苗和DNA疫苗在全新的方向上為新型疫苗的研制提供了選擇。蛋白質(zhì)疫苗是最早進(jìn)入我們視野的新型疫苗候選物，將其與多糖綴合從而研發(fā)出的肺炎球菌結(jié)合疫苗是市場(chǎng)上應(yīng)用最廣的肺炎鏈球菌疫苗。目前研發(fā)蛋白質(zhì)候選疫苗最普遍和最全面的方法之一是在疾病自然感染階段的人血清中篩選具有強(qiáng)烈反應(yīng)性的抗原。此種方法已經(jīng)為我們確定了多種肺炎鏈球菌蛋白疫苗候選物，目前圍繞這些候選物的相關(guān)研究正在積極開(kāi)展。生產(chǎn)全細(xì)胞疫苗的技術(shù)要求程度低且成本不高，為其在發(fā)展中國(guó)家的推廣創(chuàng)造了條件。然而以全細(xì)胞作為疫苗的抗原仍然存在許多問(wèn)題，如抗原之間的干擾作用，細(xì)胞在體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)可能性等，另外，尋找合適的佐劑和滅活方法也是全細(xì)胞疫苗在應(yīng)用和推廣過(guò)程中的挑戰(zhàn)。DNA疫苗仍處在研究探索階段，目前還未有較多的文獻(xiàn)記載其在人體臨床試驗(yàn)中的相關(guān)成果，但不可否認(rèn)的是，此研究方向存在巨大的潛力。