雷琦峰，蔡 維

作者單位：(442000)中國(guó)湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院眼科

0引言

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和Müller細(xì)胞等，其中Müller細(xì)胞分布在所有脊椎動(dòng)物的整個(gè)視網(wǎng)膜組織中[1]。有研究顯示Müller細(xì)胞的激活是許多視網(wǎng)膜疾病共同的改變，包括黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜脫離、缺血-再灌注損傷等[2-3]。Müller細(xì)胞上存在多種分子可參與神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)，調(diào)節(jié)離子平衡以及膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間的聯(lián)系，包括ATP敏感性K+通道、鈣激活的K+通道、Ca2+通道、Na+通道等[4-5]。其中Müller細(xì)胞的靜息電位主要由ATP敏感性K+通道決定，且ATP敏感性K+通道位于Müller細(xì)胞的終板并參與胞外神經(jīng)遞質(zhì)和離子的吸收[6]。視網(wǎng)膜病變患者的Müller細(xì)胞中，內(nèi)向整流K+電流下調(diào)，同時(shí)伴隨著靜息電位的正向移動(dòng)[7-8]，為此研究Müller細(xì)胞上K+通道的調(diào)節(jié)作用，對(duì)視網(wǎng)膜疾病的治療具有重要意義。阿柏西普是一種融合蛋白，是人VEGF受體Flt-1、KDR的細(xì)胞外區(qū)域部分與人IgG的Fc片段的結(jié)合體[9-10]，可抑制同源VEGF受體的結(jié)合和激活，具有高親和力，低解離率，與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力弱等特點(diǎn)[11]，但是對(duì)K+通道的影響還無(wú)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)具體探討了阿柏西普對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膜K+通道的影響，以期為改善視網(wǎng)膜疾病的預(yù)后提供參考，現(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

1材料和方法

1.1材料人Müller細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；阿柏西普購(gòu)自上海生工公司；噻唑藍(lán)MTT溶液購(gòu)自深圳晶美公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide, annexin Ⅴ-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、胰蛋白酶、K+熒光探針、超氧化物陰離子熒光探針、DAPI、羊抗caspase-3抗體、羊抗GAPDH抗體、抗谷氨酰胺合成酶(GS)購(gòu)自Sigma公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，型號(hào)為XP0213。

1.2方法

1.2.1Müller細(xì)胞分組與處理將人Müller細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖組用含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(33mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)組用含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基(33mmol/L葡萄糖)和100μmol/L 阿柏西普處理。

1.2.2Müller細(xì)胞K+濃度檢測(cè)采用熒光探針N-甲氧喹諾基乙酰乙酯檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)K+濃度，將按上述方法分組的Müller細(xì)胞接種于48孔板中，處理后吸棄培養(yǎng)基。每孔加入100μL 10mmol/L熒光檢測(cè)工作液，孵育1h；PBS洗滌5min×5次，倒置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光檢測(cè)，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞，記錄與計(jì)算熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Müller細(xì)胞存活率檢測(cè)將Müller細(xì)胞以5×105個(gè)/mL接種于96孔板中，按照上述方法處理后，吸棄培養(yǎng)基。加10μL劑量為5mg/mL MTT溶液與100μL無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育4h，每孔加150μL二甲基亞砜，振蕩10min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Müller細(xì)胞凋亡率檢測(cè)細(xì)胞分組同上，采用annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。用2.5g/L胰蛋白酶消化Müller細(xì)胞，收集1×106個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌1次。重懸細(xì)胞后，根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行annexin V-FITC/PI染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Müller細(xì)胞凋亡率。

1.2.5caspase-3蛋白水平檢測(cè)采用Western blot法檢測(cè)caspase-3表達(dá)情況，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，用美國(guó)BD公司的8721型凝膠分析軟件分析各蛋白目的條帶的吸光度(A)值，以A目的蛋白/AGAPDH比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1Müller細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定Müller細(xì)胞培養(yǎng)48h后呈現(xiàn)谷氨酰胺合成酶(GS)陽(yáng)性，純化度在90%以上(圖1)。

2.2K+水平對(duì)比熒光檢測(cè)顯示對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組K+相對(duì)濃度分別為(2.14±0.44)%、(23.11±4.39)%、(5.20±0.92)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.482,P<0.05)。

2.3細(xì)胞存活率對(duì)比MTT檢測(cè)顯示對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞存活率分別為(100.00±0.00)%、(73.24±4.13)%、(85.22±5.33)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.274,P<0.05)。

2.4細(xì)胞凋亡率對(duì)比流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞凋亡率分別為(5.03±1.91)%、(26.73±3.14)%、(16.63±2.73)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.284,P<0.05)，見圖2。

2.5caspase-3蛋白表達(dá)水平對(duì)比與對(duì)照組相比，高糖組Müller細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.28±1.38vs2.92±1.38,P<0.05)；與高糖組Müller細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.28±1.38vs4.29±2.40，P<0.05)，見圖3。

3討論

Müller細(xì)胞可參與視網(wǎng)膜葡萄糖代謝，對(duì)神經(jīng)元起著支持作用，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血液流動(dòng)，釋放神經(jīng)遞質(zhì)和其它神經(jīng)興奮性物質(zhì)從而直接或間接地調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，維持血-視網(wǎng)膜屏障[12]。Müller細(xì)胞也可通過(guò)釋放抗氧化物質(zhì)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，還可以通過(guò)生成神經(jīng)前體，促進(jìn)視網(wǎng)膜重生[13]。而Müller細(xì)胞膠質(zhì)化也會(huì)促使神經(jīng)退化，從而阻止視網(wǎng)膜組織的重生進(jìn)程[14]。Müller細(xì)胞和神經(jīng)元之間的功能聯(lián)系需要膠質(zhì)細(xì)胞維持相對(duì)負(fù)的膜電位，K+電流的下調(diào)將導(dǎo)致Müller細(xì)胞去極化，使其維持細(xì)胞內(nèi)外K+和水平衡功能障礙，從而嚴(yán)重影響視網(wǎng)膜的功能[15]。

阿柏西普結(jié)構(gòu)為全人源化重組融合蛋白包含VEGF受體1結(jié)合域2及VEGF受體2結(jié)合域3，4，其與VEGFA結(jié)合力均較其它VEGF藥物高，結(jié)合能力大約是雷珠單抗的30倍，貝伐單抗的50倍[16-17]。本研究熒光檢測(cè)顯示對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組K+相對(duì)濃度對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明阿柏西普的應(yīng)用能抑制Müller細(xì)胞K+水平。從機(jī)制上分析，長(zhǎng)期高糖刺激可通過(guò)葡萄糖對(duì)Müller細(xì)胞的直接或間接作用經(jīng)由多種機(jī)制造成視網(wǎng)膜損傷，也通過(guò)激活Müller的K+通道，從而導(dǎo)致Müller的活化[18]。阿柏西普具有VEGF受體2的免疫球蛋白樣區(qū)域，直接抑制K+通道，從而調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞的興奮性，從而對(duì)其他神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用[19]。

圖1Müller細(xì)胞的鏡下鑒定結(jié)果(×400)。

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Müller細(xì)胞凋亡情況aP<0.05vs對(duì)照組；cP<0.05vs高糖組。

圖3Westernblot法檢測(cè)Müller細(xì)胞caspase-3蛋白水平。

本研究顯示對(duì)照組、高糖組、實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞存活率、凋亡率對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)前多種機(jī)制參與視網(wǎng)膜病變的過(guò)程，其中包括離子通道穩(wěn)態(tài)的破壞、血管緊張素系統(tǒng)的上調(diào)、氧化應(yīng)激水平的升高等[20]。Müller細(xì)胞的凋亡是視網(wǎng)膜病變的核心病理改變，也是視網(wǎng)膜病變發(fā)生的最關(guān)鍵的原因之一。K+是機(jī)體內(nèi)最豐富的陽(yáng)離子，與細(xì)胞遷移、凋亡等多種情況密切相關(guān)；阻斷K+通道可顯著降低Müller細(xì)胞的內(nèi)源性容積調(diào)節(jié)性K+通道電流，也可改變?nèi)莘e調(diào)節(jié)性K+通道的整流特性及離子選擇性[21]。阿柏西普可以通過(guò)各種機(jī)制起著保護(hù)作用，比如抑制谷氨酸傳遞從而阻止興奮性毒性、下調(diào)K+內(nèi)流、抗氧化等；其可直接與Müller細(xì)胞上的K+通道相互作用，阻擋欲通過(guò)此通道的K+，從而調(diào)節(jié)Müller細(xì)胞的增殖與凋亡[22]。

視網(wǎng)膜是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的延伸，屬中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其組織構(gòu)成類似于腦組織，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜正常形態(tài)、功能的維持起著極其重要的作用[23]。Müller細(xì)胞可通過(guò)K+通道將胞外的K+流向胞內(nèi)，為保持神經(jīng)元內(nèi)外K+平衡提供保證。Müller細(xì)胞的死亡與丟失主要是通過(guò)凋亡和壞死兩種方式，其中凋亡是一個(gè)受到高度調(diào)節(jié)，需要消耗能量的主動(dòng)性死亡過(guò)程[24]。Caspase是凋亡過(guò)程的主要執(zhí)行者，活化的caspase-3可經(jīng)蛋白酶解過(guò)程激活后，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[25]。本研究顯示與對(duì)照組相比，高糖組Müller細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著上升(P<0.05)；與高糖組Müller細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組Müller細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)。表明K+的外流在細(xì)胞凋亡中扮演了重要角色；阻斷K+通道，也抑制了隨后的凋亡事件。本研究也存在一定的不足，沒(méi)有進(jìn)行動(dòng)物模型的體內(nèi)分析，阿柏西普的具體作用也有待明確，且對(duì)于視網(wǎng)膜細(xì)胞的作用存在單一性，將在后續(xù)研究中進(jìn)行深入分析。

總之，阿柏西普可抑制體外培養(yǎng)的高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膜K+通道，抑制高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞凋亡，降低caspase-3蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖。