劉 慧，張 敏

作者單位：(441000)中國湖北省襄陽市，湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院眼科

0引言

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病，因其形狀酷似昆蟲翅膀而得名。主要表現(xiàn)為鼻側(cè)或顳側(cè)球結(jié)膜及結(jié)膜下纖維血管組織增生，向角膜表面進行性生長，大多發(fā)生在鼻側(cè)。翼狀胬肉的生長除了影響美觀外，在侵及角膜表面和視軸區(qū)后，還可能會引起散光，影響視力。多數(shù)研究表明，翼狀胬肉的發(fā)生是在環(huán)境因素的影響下，多種因子共同作用的綜合性結(jié)果，其中新生血管在其發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要作用[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉組織中的微血管密度明顯高于正常結(jié)膜組織[5-6]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是產(chǎn)生新生血管作用最強的一種細胞因子，主要由成纖維細胞產(chǎn)生，是一種糖基化分泌性多肽因子，其與相應(yīng)受體結(jié)合后可通過調(diào)控各種信號通路，誘導新生血管形成，引起細胞增殖，內(nèi)皮遷移，增加管壁通透性。趨化因子受體3(CCR3)是趨化因子CC類受體，是由各種細胞產(chǎn)生的一種單鏈的小分子蛋白質(zhì)家族，通過與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮生物學效應(yīng)，主要表達于嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、Th2細胞等。本研究主要探究VEGF及CCR3在翼狀胬肉組織中的表達及意義。

1對象和方法

1.1對象收集2018-01/06于我院住院的翼狀胬肉患者18例18眼為試驗組，其中男10例，女8例，平均年齡56.3±9.0歲。納入標準：(1)初發(fā)翼狀胬肉；(2)翼狀胬肉組織侵入角膜緣≥3mm。排除標準：(1)術(shù)前檢查有眼部炎癥疾病，既往有眼部手術(shù)史者；(2)術(shù)前1mo接受免疫抑制劑藥物及抗凝藥物治療者；(3)2型糖尿病患者。選取同期行鞏膜扣帶環(huán)扎術(shù)的孔源性視網(wǎng)膜脫離患者14例14眼為對照組，其中男7例，女7例，平均年齡53.8±11.6歲。對照組患者排除標準同試驗組。兩組患者性別構(gòu)成比、年齡差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.098，P=1.000；t=0.700，P=0.489)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1取材試驗組患者行翼狀胬肉切除聯(lián)合自體結(jié)膜瓣移植術(shù)，術(shù)中取翼狀胬肉組織；對照組患者行鞏膜扣帶環(huán)扎術(shù)，術(shù)中取鼻側(cè)球結(jié)膜組織。組織取下后立即剪碎，一部分經(jīng)固定液固定后行HE染色觀察翼狀胬肉與正常結(jié)膜組織的差異，一部分立即用液氮低溫處理后置于-80℃冰箱保存，用于檢測VEGF和CCR3的表達水平。

1.2.2主要試劑與儀器兔抗VEGF多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，鼠抗CCR3多克隆抗體、HRP標記兔抗鼠抗體、HRP標記羊抗兔抗體(美國KPL公司)，CY3標記羊抗兔抗體、CY3標記羊抗鼠抗體(美國Jackson公司)，免疫組織化學染色試劑盒、DAB顯色劑(丹麥DAKO公司 K5007)，Trizol試劑(Invitrogen，15596-026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司，RR047A)，熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司，RR420A)；石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)，PCR儀(杭州博日科技，TC-XP)，熒光定量PCR儀(Life technologies公司，Step OneTMReal-Time PCR System)。

1.2.3HE染色樣本組織固定于4%多聚甲醛24h以上，常規(guī)脫水、包埋制石蠟切片。切片經(jīng)二甲苯Ⅰ 20min-二甲苯Ⅱ 20min-無水乙醇Ⅰ 10min-無水乙醇Ⅱ 10min-95%乙醇5min-90%乙醇5min-80%乙醇5min-70%乙醇5min-蒸餾水洗脫蠟至水。蘇木素染細胞核8min，自來水洗，1%鹽酸-乙醇分化數(shù)秒，自來水洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。伊紅染細胞質(zhì) 3min。然后將切片依次放入95%乙醇Ⅰ 5min -95%乙醇Ⅱ 5min-無水乙醇Ⅰ5min -無水乙醇Ⅱ 5min -二甲苯Ⅰ 5min -二甲苯Ⅱ 5min中脫水透明，晾干后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察拍片。

1.2.4免疫熒光染色固定組織后，予石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟后置于含抗原修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)。中火至沸后斷電間隔10min，中低火至沸，自然冷卻后將切片置于PBS緩沖液中，晃動洗滌。3% BSA封片，滴加一抗(VEGF抗體、CCR3抗體；1∶100)，平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。切片置于PBS緩沖液中，晃動洗滌。滴加二抗(CY3標記相應(yīng)二抗，1∶50)，避光室溫孵育，晃動洗滌。DAPI染液復(fù)染細胞核，晃動洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。實驗重復(fù)3次。

1.2.5免疫組織化學染色石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，滴加10%兔血清封片，滴加一抗(VEGF抗體、CCR3抗體，1∶100)，切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。滴加二抗(HRP標記相應(yīng)二抗，1∶50)，室溫孵育50min。DAB顯色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染后梯度濃度乙醇脫水透明，將切片從二甲苯中拿出來晾干，中性樹膠封片。至顯微鏡下觀察，每張切片隨機挑選200倍視野進行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，分析累積光密度值(IOD)，并計算平均光密度值(mean density)。實驗重復(fù)3次。

1.2.6qRT-PCR檢測采用Trizol法提取總RNA，根據(jù)試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，檢測VEGF和CCR3 mRNA的表達。VEGF引物序列：上游引物5’-TGCCCACTGAGGAGTCCAAC-3’；下游引物5’-TGGTTCCCGAAACGCTGAG-3’；CCR3上游引物5’-GTGTTCACTGTGGGCCTCTT-3’；下游引物5’-GTGACGAGGAAGAGCAGGTC-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列：上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’?？偡磻?yīng)體系為15μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s，60℃ 60s共40個循環(huán)，60℃～95℃做溶解曲線，每20s升溫1℃，每個樣品均設(shè)3個復(fù)孔。采用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1翼狀胬肉與正常結(jié)膜的組織學差異HE染色結(jié)果顯示，正常結(jié)膜組織可見上皮層和基質(zhì)層，基質(zhì)層組織疏松，僅見散在少量毛細血管(圖1A)；翼狀胬肉組織上皮層明顯增厚，有多層細胞，基質(zhì)層組織結(jié)構(gòu)緊密，排列紊亂，其中可見大量毛細血管及纖維組織，且血管管徑較小，管壁不完整，管腔形態(tài)不均勻，提示可能為功能不良的新生血管(圖1B)。

2.2VEGF和CCR3在翼狀胬肉和正常結(jié)膜組織中的表達免疫熒光染色結(jié)果顯示，多數(shù)正常結(jié)膜組織中幾乎檢測不到VEGF和CCR3的表達，而翼狀胬肉組織中兩者表達均較高(圖2)。試驗組18眼中，VEGF陽性表達13眼(72%)，CCR3陽性表達11眼(61%)。對照組14眼中，VEGF陽性表達4眼(28%)，CCR3陽性表達2眼(14%)。兩組患者VEGF和CCR3陽性表達率差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=6.026、7.158，P=0.031、0.012)。

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，翼狀胬肉組織中VEGF和CCR3陽性光密度值均較對照組高(圖3)。試驗組VEGF和CCR3(0.69±0.0875和0.45±0.0248)表達水平顯著高于對照組(0.05±0.0024和0.03±0.0074)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=12.822、28.618，均P<0.001)。

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，試驗組VEGF mRNA表達水平約為對照組的12倍(12.33±2.84vs1.00±0.08)，CCR3 mRNA的表達水平約為對照組的160倍(159.60±34.15vs1.00±0.09)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=14.86、17.31，均P<0.01)。

圖1HE染色觀察翼狀胬肉與正常結(jié)膜組織形態(tài)(×200)
A：正常結(jié)膜組織鏡下可見單層上皮，基質(zhì)層疏松，少量散在毛細血管；B：翼狀胬肉組織鏡下可見上皮增厚，多層細胞，基質(zhì)層排列紊亂，有大量毛細血管及纖維組織。

圖2免疫熒光染色檢測VEGF和CCR3的表達(×200)
A：正常結(jié)膜組織VEGF表達；B：正常結(jié)膜組織CCR3表達；C：翼狀胬肉組織VEGF表達；D：翼狀胬肉組織CCR3表達。藍色表示細胞核，紅色表示VEGF/CCR3表達陽性。

圖3免疫組織化學染色檢測VEGF和CCR3的表達(×200)
A：正常結(jié)膜組織VEGF表達；B：正常結(jié)膜組織CCR3表達；C：翼狀胬肉組織VEGF表達；D：翼狀胬肉組織CCR3表達。

3討論

翼狀胬肉是眼球表面的一種慢性、炎癥性疾病，其具體的發(fā)病機制尚不完全明確。目前研究認為，翼狀胬肉主要是在環(huán)境因素的作用下，由多種細胞因子共同參與的增殖性疾病，即眼表在局部缺氧和長期慢性炎癥刺激下，引起全身及局部趨化因子聚集，導致翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展，而新生血管在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[7-10]。本研究通過組織學分析發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉組織中上皮增生及血管化程度較正常結(jié)膜組織顯著。另有研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉組織中上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞中VEGF表達遠遠高于正常球結(jié)膜組織，免疫應(yīng)答反應(yīng)也較高[11]，且在翼狀胬肉患者中，VEGF在特應(yīng)性患者中的表達較非特應(yīng)性患者高[12]。翼狀胬肉患者結(jié)膜下注射抗VEGF藥物貝伐單抗1wk時癥狀明顯好轉(zhuǎn)[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉和正常結(jié)膜組織中VEGF的表達水平有顯著差異，表明VEGF在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。推測可將抗VEGF藥物作為治療翼狀胬肉的藥物學方法或輔助手術(shù)用藥。CCR3是趨化因子CC類受體，可使細胞發(fā)生遷移、活化效應(yīng)，促進趨化因子反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，CCR3可能在新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)等脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)性疾病中發(fā)揮作用[14-16]。赫雪飛[17]研究發(fā)現(xiàn)，在堿燒傷誘導的小鼠角膜新生血管(CRNV)模型中早期運用CCR3拮抗劑能抑制CRNV形成，提示CCR3可能參與CRNV的形成。本研究結(jié)果表明，CCR3在翼狀胬肉組織中的表達水平顯著高于正常結(jié)膜組織，提示CCR3可能是參與翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展的一個重要因子，其具體作用機制可能與新生血管發(fā)生及促進炎癥因子的表達有關(guān)，但仍需進一步研究證實。多項研究顯示，CCR3在小鼠視網(wǎng)膜新生血管中呈高表達，且抗CCR3治療可以抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成[18-19]。Nagai等發(fā)現(xiàn)CCR3與CNV的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并且在鼠和靈長類動物1眼行玻璃體腔內(nèi)注射抗CCR3藥物，另1眼的受累程度明顯減輕，提示抗CCR3藥物在抗新生血管方面有著重要價值[20-21]。推測CCR3拮抗劑的應(yīng)用可能成為翼狀胬肉的另一藥物治療方案。

研究發(fā)現(xiàn)，CCR3和VEGF信號通路在引起CNV的過程中存在交叉影響，CCR3被配體激活后可引起血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)磷酸化，從而促進脈絡(luò)膜內(nèi)皮細胞(CEC)遷移和Rac1活化，引起新生血管的產(chǎn)生[22]。本研究發(fā)現(xiàn)翼狀胬肉組織中VEGF和CCR3的表達均顯著升高，提示二者在新生血管形成過程中可能發(fā)揮協(xié)同作用，即在環(huán)境及局部炎癥因素刺激下，CCR3被配體激活后可能上調(diào)VEGF表達水平，引起一系列生物學效應(yīng)，但具體機制尚待進一步研究證實。

綜上所述，與正常結(jié)膜組織相比，翼狀胬肉組織中VEGF和CCR3表達均增高，提示VEGF和CCR3可能共同參與翼狀胬肉的發(fā)病過程，聯(lián)合抗VEGF及抗CCR3治療可作為翼狀胬肉切除手術(shù)的輔助治療方法。