陳佩瑤，張?jiān)聢A，王惠蕓，陳祖君，王靈芝*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 102488；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外醫(yī)院SICU，北京 100037

決明子為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子，主產(chǎn)于浙江、安徽、廣東及四川等地[1]。決明子性微寒，味咸、苦、甘，歸大腸、腎、肝經(jīng)；決明子具有藥用、茶飲開發(fā)、養(yǎng)生開發(fā)價值，是中藥臨床和中藥保健的重要藥材[2]。決明子炒制品寒瀉之性緩和，有平肝養(yǎng)腎、降血壓、降血脂等功效[3]。

高血壓是心血管疾病的主要危險因素之一，嚴(yán)重威脅著人類健康[4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)是一線降壓藥物，但其不良反應(yīng)明顯，會引起口干、非劑量依賴性咳嗽、味覺失常、腎衰、先天性異常、低風(fēng)險的血管神經(jīng)性水腫甚至死亡[5]，因此，尋找新型ACEI已成為近幾年的熱點(diǎn)。與ACEI相比，食源性降壓肽具有安全性高，不良反應(yīng)小[6-7]等特點(diǎn)，目前已從動植物中獲得大量ACE抑制肽，Li等[8]從泥鰍蛋白水解物中獲得四肽Ala-His-Leu-Leu，可使SHR(原發(fā)性高血壓大鼠)血壓降低22.1 mmHg。Lunow等[9]發(fā)現(xiàn)，雞蛋清溶菌酶的酶解產(chǎn)物有很強(qiáng)的ACE抑制活性，獲得了2個二肽Ala-Try和Try-Try，IC50分別是20、68 μmol·L-1；Jang等[10]發(fā)現(xiàn)，小平菇水提物能降低SHR血壓50 mmHg，并從中分離到Arg-Leu-Pro-Ser-Glu-Phe-Asp-Leu-Ser-Ala-Phe-Leu-Arg-Ala和Arg-Leu-Ser-Gly-Gln-Thr-Ile-Glu-Val-Thr-Ser-Glu-Tyr-Leu-Phe-Arg-His。近據(jù)報(bào)道，薏苡仁[11]、麥芽[12]、蜈蚣[13]、醋豆[14-15]等中藥中均富含ACE抑制肽。決明子為中醫(yī)臨床常用降壓藥物，決明子作為降壓片主要藥材收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊?！躲y海精微》記載：決明散主治肝腎陰虧、風(fēng)熱上擾、眼見黑花不散。肖伍華等[16]觀察決明子臨床治療高血壓病例，有效病例為92%。決明子30 g研末沖服，治療高血壓有效率達(dá)93.02%[17]。決明子蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)消化后產(chǎn)生的多肽組分是否具有降壓活性尚未有相關(guān)報(bào)道，故本文對炒決明子蛋白質(zhì)組成及其酶解物ACE抑制活性進(jìn)行研究，為該藥材降壓肽的獲得及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡釋提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BT 224S型電子分析天平(德國Sartorius公司)；FW100型高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ-300 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SR-JX-4-13型高溫電阻爐(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；Epoch酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；WXG-4型旋光儀(上海申光儀器儀表有限公司)；PowerPac 3000電泳儀(美國Bio-Rad公司)；TS-8脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；全自動旋光儀(美國魯?shù)婪蚬?；Waters高效液相色譜儀。

1.2 試藥

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE，批號9015-82-1，美國Sigma公司)；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL，批號1001510772，美國Sigma公司)；胃蛋白酶(批號01535535，美國Sigma公司)；其他試劑均為分析純。

炒決明子CassiatoraL.，批號17042403，產(chǎn)地廣西，購于北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為豆科植物小決明子CassiatoraL.清炒制得。

2 方法

2.1 炒決明子主成分分析

根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典》，分別對炒決明子進(jìn)行蛋白質(zhì)含量、粗脂肪含量、水分和灰分的含量進(jìn)行測定[1]。

2.1.1 蛋白質(zhì)含量測定 精密稱取樣品，經(jīng)濃硫酸消化后，在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨氣，氨氣隨水蒸氣蒸餾出來并被過量的硼酸溶液吸收，最后用質(zhì)量濃度為0.01 mol·L-1的鹽酸滴定。計(jì)算公式：

(1)

其中V2、V1分別為滴定樣品和滴定空白消耗鹽酸平均數(shù)(mL)，C為酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mol·L-1)，14為氮的原子量，6.25為系數(shù)，W為樣品克數(shù)。

2.1.2 粗脂肪含量測定 精密稱取樣品，加入已干燥至恒重的濾紙筒內(nèi)，石油醚回流提取樣品粗脂肪8 h后，烘干樣品稱質(zhì)量。計(jì)算公式：

(2)

m0為濾紙筒質(zhì)量，單位為克；m1為提取前樣品和濾紙總質(zhì)量，單位為克；m2為提取后樣品和濾紙筒總質(zhì)量，單位為克。

2.1.3 水分含量測定 精密稱取供試品，在干燥至恒重的稱量瓶中平鋪均勻，精密稱定后，開啟瓶蓋在105 ℃下干燥5 h，放冷30 min，精密稱定，再于上述溫度干燥1 h，再次放冷和稱質(zhì)量。根據(jù)減失的質(zhì)量，計(jì)算供試品的含水量(%)。

2.1.4 灰分測定 精密稱取供試品，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質(zhì)量，緩緩熾熱，至完全碳化時，逐漸升高溫度至500～600 ℃，使完全灰化并至恒質(zhì)量，根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品總灰分含量。

2.1.5 淀粉含量測定 精密稱取(2.5±0.05)g(m1)待測樣品，用稀鹽酸水解，在澄清和過濾后用旋光法測定總旋光度α1[18]。精密稱取(5±0.1)g(m2)待測樣品，用體積分?jǐn)?shù)為40%的乙醇溶液萃取出可溶性糖和相對分子量低的多糖，濾液處理同上，測定旋光度值α2。兩種方法測量結(jié)果的差值，乘以系數(shù)，即為樣品的淀粉含量。計(jì)算公式：

(3)

α1為樣品總旋光度值，單位為度；α2為樣品中醇溶物質(zhì)旋光度值，單位為度；m1為總測定樣品的質(zhì)量，單位為克；m2為醇溶測定樣品的質(zhì)量，單位為克；w1為測定樣品中干物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；300為豆類淀粉在589.3 nm波長測得的比旋度，單位為度。

2.2 決明子蛋白質(zhì)的提取

2.2.1 總蛋白的提取 炒決明子粉碎后過40目篩子，石油醚脫脂，真空干燥，采用50 mmol·L-1KH2PO4-NaOH(pH=8.0)緩沖液抽提蛋白，固液比1∶10(w∶v)，4 ℃磁力攪拌10 h，5000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入硫酸銨至55%飽和度，離心收集沉淀，緩沖液溶解蛋白沉淀，雙蒸水低溫透析(截留分子量3.5 KDa)24 h，期間換水?dāng)?shù)次，冷凍干燥后備用[19]。Bicinchoninic acid(BCA)法[20]測定蛋白含量。

2.2.2 決明子蛋白質(zhì)組分的抽提 采用順序抽提法提取決明子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[21]。炒決明子經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，脫脂，依次采用雙蒸水、0.5 mol·L-1氯化鈉溶液、70%乙醇溶液(0.5%乙酸鈉)、0.012 5 mol·L-1硼酸鈉緩沖液(1%十二烷基硫酸鈉、2%β-巰基乙醇)振蕩抽提60 min，10 000 r·min-1離心15 min，重復(fù)2次，分別提取清、球、醇溶及谷蛋白組分。雙蒸水低溫透析24 h(截留分子量3.5 KDa)，期間換水?dāng)?shù)次，然后冷凍干燥備用。

2.3 SDS-PAGE

采用垂直板不連續(xù)體系[22]，將樣品溶液與上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，冰浴10 min，取適量樣品上樣。設(shè)置濃縮膠恒定電壓60 V，分離膠恒定電壓120 V?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色3 h，置脫色液(水∶95%乙醇∶冰醋酸=17∶2∶1)中室溫脫色，直至蛋白條帶清晰，背景干凈。

2.4 決明子小分子量多肽的制備

采用蛋白酶水解法制備決明子小分子多肽組分[23]。精確稱取炒決明子原藥材粉末、清、球、醇溶和谷蛋白凍干粉及蛋白提取殘?jiān)梦傅鞍酌杆?，水解條件為：底物濃度2%，酶與底物濃度比1∶10，pH=2.0，溫度37 ℃，時間48 h。水解后將樣品95 ℃變性5 min，冰浴10 min，再經(jīng)8000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液備用。

將備用的上清液轉(zhuǎn)移至超濾管(截留分子量3 KD)5000 r·min-14 ℃離心30 min，收集濾過液，制備小分子肽(≤3 KD)[11，24]，冷凍干燥后備用。采用Lowry法測定多肽濃度[25]

2.5 ACE抑制活性的測定

采用高效液相色譜法進(jìn)行樣品ACE抑制活性測定[23]。用硼酸緩沖液(0.1 mol·L-1硼酸，0.3 mol·L-1NaCl，pH=8.3)溶解樣品。反應(yīng)體系為：樣品溶液10 μL、ACE(2 mU)20 μL和HHL(2 mM))20 μL。

采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，TIANHE)分析樣品。洗脫條件：流動相A∶流動相B=25∶75[A：乙腈，B：超純水(含0.05% TFA，v/v)]，液相流速為1 mL·min-1，柱溫箱的柱溫為30 ℃，樣品的進(jìn)樣量為10 μL，檢測器于228 nm下進(jìn)行檢測，根據(jù)HA峰面積計(jì)算ACE抑制率。

ACE抑制率(%)=(A-B)/A×100%

(4)

A為空白對照組的HA峰面積，B為樣品組的HA峰面積。

3 結(jié)果

3.1 決明子主要成分分析

決明子主要成分含量如下。淀粉含量最高，占總質(zhì)量的(46.44±0.66)%，蛋白質(zhì)含量為(22.08±0.04)%，粗脂肪為(14.07±0.14)%，水分和灰分含量分別為(6.67±0.06)%和(5.45±0.04)%，符合2015版《中華人民共和國藥典》相關(guān)規(guī)定。

3.2 炒決明子蛋白組成分析

采用BCA法對水溶性總蛋白含量進(jìn)行測定。水溶性蛋白占總蛋白含量的(4.52±0.17)%，含量較低。故采用順序抽提法提取蛋白進(jìn)行蛋白組分的分析。

采用凱氏定氮法對決明子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白組分進(jìn)行含量測定，結(jié)果見表1。清蛋白占總蛋白含量的(14.55±0.01)%，球蛋白占(14.87±0.03)%，醇溶蛋白和谷蛋白分別占(2.67±0.01)%和(21.04±0.03)%，殘?jiān)腥允Ｓ?6.89%蛋白質(zhì)。

四類蛋白組分經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，得到的電泳圖譜見圖1。清蛋白條帶豐富，主要分布在14、24、30、58 KD；球蛋白條帶主要分布在14、20、30、40～50 KD；谷蛋白條帶在24、30、62、100 KD均有分布。醇溶蛋白由于含量低，未檢測出明顯條帶。

表1 炒決明子蛋白質(zhì)組分分布 %

注：1.球蛋白；2.清蛋白；3.標(biāo)準(zhǔn)分子量；4.谷蛋白；5.醇溶蛋白。圖1 炒決明子蛋白組分SDS-PAGE圖譜

3.3 決明子小分子肽ACE抑制活性分析

采用高效液相法測定各蛋白源多肽組分的ACE抑制活性，見圖2～3。圖2a為對照品HHL的色譜圖，保留時間為11.0 min?？瞻讓φ战M(硼酸緩沖液)沒有ACE抑制活性(見圖2b)；清、球、醇溶蛋白及谷蛋白酶解產(chǎn)物(3 KD，0.01 mg·mL-1)具有不同程度的ACE抑制活性。球蛋白酶解物的ACE抑制率為(38.44±1.54)%(見圖2c)，活性最高。清蛋白酶解物和醇溶蛋白酶解物的抑制率分別為(29.39±1.60)%(見圖2e)和(30.48±1.91)%(見圖2f)，谷蛋白酶解物抑制率為(4.30±0.86)%(見圖2g)。陽性藥卡托普利(2×10-9mol·L-1)的抑制率為(46.47±1.08)%(見圖2d)。殘?jiān)蚝写罅坑驳鞍?，水解物所得ACE抑制率為(17.59±2.70)%。

注：a.HHL；b.空白；c.球蛋白源小分子肽；d.卡托普利；e.清蛋白源小分子肽；f.醇溶蛋白源小分子肽；g.谷蛋白源小分子肽。圖2 樣品的RP-HPLC圖

注：*代表不同樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*#代表該兩組樣品與只標(biāo)*的其他樣品的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，標(biāo)有*#兩組樣品間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3 各多肽組分ACE抑制率

4 討論

決明子中水溶性和脂溶性苷類化合物具有降低SD大鼠血壓和心率作用，且其功能的發(fā)揮與隨體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)[26-27]。決明子水提物具有降低DBA/2J青光眼大鼠眼內(nèi)壓的作用，同時前房水乳酸脫氫酶水平降低[28]。李續(xù)娥等[29]報(bào)道，決明子蛋白質(zhì)可顯著降低血壓，降壓效果與決明子低聚糖、蒽醌苷和復(fù)方利血平無顯著差異，然而持續(xù)性不如后兩者。本研究通過順序抽提法依次提取決明子四類蛋白組分，進(jìn)而采用胃蛋白酶法獲得小分子肽，結(jié)果表明，球蛋白酶解產(chǎn)物具有良好的ACE抑制活性。后續(xù)將采用不同的色譜方法對其進(jìn)一步分離純化，有望從中獲得高效中藥源降壓藥物，也為該藥的臨床用藥提供了新的理論指導(dǎo)。