呂晨菲，王茂思，黃唯子，楊靜慧，劉艷軍，黃俊軒

藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立和優(yōu)化

呂晨菲，王茂思，黃唯子，楊靜慧通信作者，劉艷軍，黃俊軒

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384）

為建立適合藍(lán)莓花芽的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)體系，以天津市薊州區(qū)主栽藍(lán)莓品種‘布里吉塔’休眠花芽為試材，采用TCA/丙酮法提取藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)，選擇5種蛋白質(zhì)上樣量（2.00、2.25、2.50、2.75、3.00 mg）、2種聚焦電壓（8 000、10 000 V）、3種聚焦時間（6、7、8 h）進(jìn)行雙向電泳，R-250考染后，進(jìn)行圖譜比較分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)上樣量3.00 mg，聚焦電壓8 000 V，聚焦時間為8 h，可得到蛋白數(shù)目多、分辨率高的藍(lán)莓休眠花芽雙向電泳圖譜。建立了適合藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)的雙向電泳體系，為開展藍(lán)莓蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究奠定了基礎(chǔ)，更為藍(lán)莓花芽休眠及解除休眠分子機制的研究提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

藍(lán)莓；花芽；蛋白質(zhì)；雙向電泳

藍(lán)莓是重要的經(jīng)濟型小漿果類果樹，具有較高的營養(yǎng)價值及保健功效，是近年我國發(fā)展最快的果樹之一[1]。但藍(lán)莓不耐貯藏，自然成熟的果實成熟期短而集中，無法實現(xiàn)周年供應(yīng)[2]。促成栽培是通過人工加溫的方法使藍(lán)莓提前成熟，延長鮮果的貨架期，供應(yīng)淡季市場，提高果實商品價值，為農(nóng)民實現(xiàn)創(chuàng)收。而藍(lán)莓促成栽培的關(guān)鍵，是其休眠花芽是否完全解除了自然休眠。隨著后基因組時代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)研究已成為前沿領(lǐng)域[3]，通過雙向電泳技術(shù)可以從分子水平上了解藍(lán)莓花芽休眠及解除機制，在實際生產(chǎn)中，通過分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，導(dǎo)入相關(guān)的蛋白/基因，最終達(dá)到人工調(diào)控藍(lán)莓休眠的目的。

雙向電泳（2-DE）技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究成功的前提和關(guān)鍵[4]，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)獲得的差異蛋白點可以反映植物在不同條件下的生理狀態(tài)及其調(diào)控機制，已成為生物學(xué)研究的熱點。

目前，關(guān)于果樹雙向電泳體系研究很多[5]。朱飛冀等優(yōu)化了芒果葉片雙向電泳體系[6]；馮浩等探究了蘋果樹腐爛病菌菌絲蛋白雙向電泳體系[7]；王瑞璞等建立了葡萄種子蛋白質(zhì)雙向電泳體系[8]，但并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)藍(lán)莓雙向電泳體系的研究。不同植物的生物學(xué)特性、生理生化特征有很大差異，到目前為止，沒有一種雙向體系可以通用于所有試材[9]。因此，結(jié)合不同植物和不同材料組織的特點摸索出最佳的雙向電泳條件顯得至關(guān)重要。本研究通過對藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)上樣量、聚焦電壓、聚焦時間等雙向電泳條件進(jìn)行探索，以期獲得分辨率、重復(fù)性高的2-DE圖譜，為開展藍(lán)莓蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定基礎(chǔ)，更為藍(lán)莓花芽休眠及解除休眠分子機制的研究提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2018年11月中旬于天津市薊州區(qū)馬伸橋藍(lán)莓試驗基地，選取8年生健壯、無病蟲害的‘布里吉塔’藍(lán)莓的休眠花芽，即刻液氮處理，并保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 蛋白質(zhì)樣品的制備與定量

1.2.1 蛋白質(zhì)提取

參照Carpentier等[10]的TCA-丙酮法進(jìn)行。

（1）沉淀：在裝有花芽粉末的15 mL離心管中加入1 mL 100%三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）、4 mL 0.07%β-巰基乙醇丙酮溶液（-20 ℃預(yù)冷），充分振蕩混勻后置于-20 ℃沉淀過夜；

（2）清洗：4 ℃，7 800 r/min離心30 min后棄上清。沉淀中加4 mL丙酮（-20 ℃預(yù)冷）以及1 mL 0.07%β-巰基乙醇丙酮溶液（-20 ℃預(yù)冷），并重懸沉淀。重復(fù)此過程直至上清液接近無色透明。清洗完成后棄上清液，將沉淀暴露在-20 ℃環(huán)境中使丙酮完全揮發(fā)。將得到的蛋白質(zhì)干粉末分裝于2 mL離心管中（裝至管體積的1/4處）。

1.2.2 蛋白質(zhì)裂解

在蛋白質(zhì)粉末中加入1 mL裂解液（0.48 g的8 mmol/L尿素，0.15 g的2 mmol/L硫脲，0.04 g的4%CHAPS，加去離子水溶解并定容至1 mL），劇烈震蕩混勻后，放入超聲清洗儀進(jìn)行清洗（25 ℃，40%功率，5 min），結(jié)束后取出劇烈震蕩30 s，重復(fù)此過程8次后進(jìn)行離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min），取上清液。

1.2.3 蛋白質(zhì)濃度的測定

選用Bradford法[11]進(jìn)行測定。

1.3 雙向電泳與圖譜分析

1.3.1 水化上樣

采用GE公司24 cm、pH3-10的IPG膠條，被動水化方式上樣。根據(jù)測得的樣品蛋白濃度（7.96 mg/mL），分別吸取200、250、300、350、400 μL蛋白樣品溶液，加IPG buffer原液2.5 μL、1%溴酚藍(lán)溶液0.5 μL并用去離子水補齊體積，總計450 μL。

1.3.2 一向IEF電泳

IEF聚焦程序設(shè)定：Step1～Step3（100 V，0.5 h；500 V，0.5 h；1 000 V，1 h）是低壓除鹽過程；Grd1-Grd3（2 000 V，0.5 h；6 000 V，2 h；10 000 V，2 h）是梯度升壓過程；Step4（8 000/10 000 V，48 000/56 000/64 000 V）是等電聚焦過程；Step5（500 V，12 h）是保存膠條。將一向完成的膠條沖洗并進(jìn)行2步平衡[12]。

1.3.3 二向SDS-PAGE電泳

取出膠板，沖洗擦拭并轉(zhuǎn)移至聚丙烯酰胺凝膠（12.5%，厚1.5 mm）界面，排除氣泡，用加熱后的20%低熔點瓊脂糖（含溴酚藍(lán)）封膠。

首先用低功率1 W/gel（600 V，400 mA，0.5 h），當(dāng)樣品完全走出IPG膠，濃縮成一條線后，加大功率為13 W/gel（600 V，400 mA，7 h），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣停止電泳。

1.3.4 蛋白質(zhì)染色與凝膠掃描分析

將膠塊放入20%TCA固定液處理1 h。再用CBB-R250染色液（2.5 g CBB-R250；450 mL無水乙醇；100 mL冰乙酸；450 mL去離子水）染色4 h。隨后用脫色液（250 mL無水乙醇；80 mL冰醋酸；670 mL去離子水）脫色至背景清晰（期間每4 h更換一次脫色液，脫色時間約為12 h）。

脫色完成后的凝膠使用Image Scanner III掃描儀進(jìn)行掃描。掃描后的圖像使用Adjust Contrast功能進(jìn)行圖像調(diào)整。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)雙向電泳上樣量的優(yōu)化

圖1為藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)在5種不同上樣量條件下，凝膠圖像效果的比對。圖1a上樣量為2.00 mg，蛋白質(zhì)點數(shù)量少、顏色淺；圖1b上樣量為2.25 mg，背景干凈，蛋白點圓潤清晰，但數(shù)量仍較少；圖1c上樣量為2.50 mg，出現(xiàn)明顯的橫縱條紋，蛋白點數(shù)量增多，分布均勻，但顏色較淺；圖1d上樣量為2.75 mg，背景較干凈，條紋有所緩解，蛋白質(zhì)點分布均勻且顏色適中，但小分子蛋白質(zhì)點較少；圖1e上樣量為3.00 mg，蛋白質(zhì)點數(shù)量明顯增多，特別是小分子量蛋白質(zhì)點增加較多，且背景條紋減少。綜上，上樣量為3 mg時，蛋白質(zhì)點圓潤清晰，蛋白質(zhì)點數(shù)量最多，橫縱紋現(xiàn)象減輕，拖尾較輕，電泳效果最好，滿足試驗要求。

圖1 不同上樣量的比較

注：a：2.00 mg，b：2.25 mg，c：2.50 mg，d：2.75 mg，e：3.00 mg

2.2 藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)雙向電泳聚焦電壓優(yōu)化

圖2a和圖2b分別是在8 000 V、10 000 V電壓條件下聚焦8 h的電泳圖。圖2a蛋白質(zhì)點圓潤清晰，背景干凈，點的拖尾情況很少，滿足試驗要求。圖2b的蛋白質(zhì)點雖清晰，但由于電壓太高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)漂移，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)點減少，且背景不如圖2a干凈。綜上，選擇8 000 V聚焦電壓進(jìn)行試驗效果最佳。

圖2 不同聚焦電壓的比較

注：a：8 000 V，b：10 000 V

2.3 藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)雙向電泳聚焦時間優(yōu)化

8 000 V電壓下不同聚焦時間的電泳圖如圖3所示。圖3a聚焦時間為6 h，背景有明顯陰影、縱紋和橫紋，以縱紋為界，左側(cè)無蛋白點出現(xiàn)，分析原因可能是聚焦時間不足；圖3b增加聚焦時間至7 h，橫縱紋現(xiàn)象明顯減輕，且蛋白質(zhì)點分布均勻、圓潤清晰，但背景仍不夠干凈；圖3c增加聚焦時間至8 h后，背景變得清晰，蛋白質(zhì)點清晰規(guī)整，橫縱紋現(xiàn)象稍有增加，但是并不影響后續(xù)的軟件分析效果。綜上，選擇8 h聚焦時間最佳。

圖3 不同聚焦時間的比較

注：a：6 h，b：7 h，c：8 h

3 討論

3.1 上樣量對2-DE圖譜的影響

藍(lán)莓休眠花芽相對于葉片等高度分化的植物組織，具有很強的分化能力，蛋白質(zhì)成分復(fù)雜，小分子蛋白質(zhì)量多，提高電泳上樣量有利于樣品中低豐度蛋白質(zhì)的檢出。但若上樣量過高，則易引起蛋白質(zhì)聚集和沉淀，導(dǎo)致高豐度蛋白質(zhì)重疊，掩蓋低豐度蛋白質(zhì)的表達(dá)[13-14]。因此合適的上樣量應(yīng)使2-DE圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)的增加與圖譜質(zhì)量之間取得平衡。上樣量的多少與樣品種類、上樣方式、IPG 膠條長度及 pH范圍等因素相關(guān)[6]。在樣品種類（藍(lán)莓休眠花芽）、pH 3～10、24 cm IPG膠條、考染、被動水化等電泳條件均確定的情況下，應(yīng)選擇適宜上樣量來提高藍(lán)莓休眠花芽2-DE體系低豐度蛋白的檢測。鑒于試材蛋白質(zhì)濃度測定值在6.7～7.2 mg/mL，而GE公司pH 3～10、24 cmIPG膠條的推薦上樣體積為450 μL，所以理論的藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)樣品的最大上樣量應(yīng)為3.24 mg，但I(xiàn)PG buffer、溴酚藍(lán)等必然會占據(jù)一定的體積，GE的操作說明中也推薦加入水分，因此，本試驗設(shè)置了5個梯度遞增的蛋白質(zhì)樣品上樣量（最大值小于3.24 mg）進(jìn)行比對試驗。多次重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣量為3.00 mg時，低豐度蛋白質(zhì)點最多，且最清晰，最大程度的滿足了藍(lán)莓休眠花芽，對檢出大量低豐度蛋白質(zhì)點的訴求，為后期試驗的準(zhǔn)確進(jìn)行，提供了保障。

3.2 聚焦電壓對2-DE圖譜的影響

Wildgruber等，丁永強等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，等電聚焦電壓對蛋白質(zhì)在 IPG 膠條中均勻分布和進(jìn)一步2-DE電泳分離有著直接的影響。在確定了藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)提取方法、蛋白質(zhì)樣品最佳上樣量的前提下，可根據(jù)試驗材料的不同，調(diào)整聚焦電壓，進(jìn)行有效的除雜處理，緩解圖譜中橫縱條紋的產(chǎn)生，優(yōu)化電泳體系。陳劍成等[17]研究凹葉厚樸葉片蛋白2-DE時，發(fā)現(xiàn)10 000 V的聚焦電壓最合適；宋學(xué)東等[18]對白樺花芽蛋白質(zhì)進(jìn)行2-DE時發(fā)現(xiàn)，8 000 V是最佳聚焦電壓；謝進(jìn)等[19]研究毛白楊芽2-DE時，發(fā)現(xiàn)聚焦電壓為4 000 V達(dá)到最佳聚焦效果。本研究發(fā)現(xiàn)，在其他電泳條件均一致的前提下，藍(lán)莓休眠花芽蛋白聚焦電壓采用8 000 V時，所得 2-DE圖譜分辨率好，蛋白點形狀圓潤規(guī)則，橫縱擴散紋理均有所緩解，聚焦效果佳。

3.3 聚焦時間對2-DE圖譜的影響

等電聚焦時間是蛋白質(zhì)電泳體系的一個重要參數(shù)[20]。如果聚焦時間過短，蛋白不能移動到其對應(yīng)的pI點，2-DE圖譜容易出現(xiàn)橫條紋；聚焦時間過長，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極移動[21]。邱智敏等[22]研究油茶雌蕊蛋白2-DE時發(fā)現(xiàn)，聚焦時間7.75 h聚焦效果最佳；歐高政等[23]研究‘四季蜜’龍眼花芽蛋白2-DE時發(fā)現(xiàn)，聚焦時間5 h時高豐度和低豐度蛋白都有較好的分離效果；葉婕等[24]研究金釵石斛花芽蛋白2-DE，發(fā)現(xiàn)9 h聚焦充分，蛋白質(zhì)點清晰。綜上可知，在其他電泳條件均相同的情況下，通過等電聚焦時間的調(diào)整，可以使聚焦更充分，從而提高了蛋白質(zhì)點的分離效果。本試驗中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓休眠花芽蛋白在8 000 V聚焦電壓，聚焦6 h條件下，橫向條紋明顯，蛋白質(zhì)聚焦不完全，將聚焦時間增加到8 h，圖譜分辨率較高，小分子蛋白質(zhì)點數(shù)量增多，聚焦效果明顯改善。

4 結(jié)論

以藍(lán)莓休眠花芽為試材，建立了適用于藍(lán)莓休眠花芽蛋白質(zhì)的雙向電泳體系：TCA/丙酮法提取蛋白質(zhì)，選用24 cm pH 3～10線性膠條和12.5% SDS-PAGE膠分離蛋白質(zhì)，上樣量3.00 mg，聚焦電壓8 000 V，聚焦時間8 h，考馬斯亮藍(lán)R250染色，得到的雙向電泳圖譜背景清晰，分辨率高。

[1] 李波. 藍(lán)莓休眠生理及分子機制研究[D]. 大連：大連理工大學(xué)，2015.

[2] 劉思. 赤霉素解除藍(lán)莓芽休眠的作用及機制[D]. 大連：大連理工大學(xué)，2017.

[3] Rampitsch，Christof，Bykova. Proteomics and plant disease: advances in combating a major threat tothe global food supply[J]. Proteomics，2012，12（4/5）：673-690.

[4] Inagaki N，Katsuta K. Large gel two-dimensional electrophoresis：improving recovery of cellular proteome[J]. Current Proteomics，2004，1（1）：35-39.

[5] 王清，產(chǎn)祝龍，秦國政，等. 果實蛋白質(zhì)組學(xué)研究的實驗方法[J].植物學(xué)報，2009，44（1）：107-116.

[6] 朱飛冀，詹儒林，柳鳳，等. 芒果葉片雙向電泳體系的建立及優(yōu)化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（2）：814-819.

[7] 馮浩，王海英，馮雅瓊，等. 蘋果樹腐爛病菌菌絲蛋白雙向電泳體系的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2017，45（6）：155-162.

[8] 王瑞璞，崔蕾，張小瑩，等. 葡萄種子蛋白質(zhì)雙向電泳體系的建立[J]. 北方園藝，2015（20）：86-91.

[9] 馬斌，孫駿威，余初浪，等. 枇杷葉片和果實總蛋白質(zhì)提取及雙向電泳的優(yōu)化方法[J]. 果樹學(xué)報，2011，28（2）：358-362.

[10] Carpentier S，Witters E，Laukens K. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues：an evaluation of different methods for two-diensionalgel electrophoresis analysis[J]. Proteomics，2005（5）：5157-5192.

[11] Bradford?M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72（7）：248–254

[12] 郭堯君．蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)[M]．北京: 科學(xué)出版社，2005．

[13] 魏開華，應(yīng)天翼. 蛋白質(zhì)組學(xué)實驗技術(shù)精編[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[14] Wang W，Tai F，Chen S. Optimizing protein extraction from plant tissues for enhanced proteomics analysis[J]. Journal of Separation Science，2008，31（11）：2032-2039.

[15] Wildgruber R，Harder A，Obermaier C，et al. Towards higher resolution：two-dimensional electrophoresis ofproteins using overlapping narrow immobilized pH gradients[J]. Electrophoresis，2000，21：2610-2616.

[16] 丁承強，馬丹，王紹華，等. 水稻蛋白質(zhì)組雙向電泳優(yōu)化流程及方法[J]. 植物學(xué)報，2011，46（1）：67-73.

[17] 陳劍成，沈少炎，蔡月琴，等. 凹葉厚樸葉片蛋白提取及雙向電泳體系的優(yōu)化[J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，45（2）：11-16.

[18] 宋學(xué)東，李慧玉，姜靜，等. 白樺花芽蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)的建立[J]. 生物技術(shù)通訊，2006（6）：901-903.

[19] 謝進(jìn)，田曉明，劉淑欣，等. 適用于毛白楊芽雙向電泳分析的蛋白質(zhì)提取方法[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，35（4）：144-148.

[20] 劉麗娟，舒烈波，陳海榮，等. 適用于生菜葉片蛋白質(zhì)雙向電泳方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2009，10（1）：106-110.

[21] 王海燕，王斌，王丹，等. 等電聚焦強度對木薯葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離結(jié)果的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報，2011，32（12）：2367-2372.

[22] 邱智敏，鄭碧娟，陳輝，等. 油茶雌蕊蛋白雙向電泳分離體系的建立[J]. 熱帶作物學(xué)報，2016，37（3）：548-554.

[23] 歐高政，陳清西.‘四季蜜’龍眼花芽總蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報，2014，35（6）：1095-1101.

[24] 葉婕，尹麗梅，葉慶生. 金釵石斛花芽蛋白質(zhì)提取及其雙向電泳體系優(yōu)化[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016，48（2）：67-73.

Establishment and optimization of two-dimensional electrophoresis system for proteins in dormant flower-bud of blueberry

Lü Chen-fei, WANG Mao-si, HUANG Wei-zi, YANG Jing-huiCorresponding Author, LIU Yan-jun,HUANG Jun-xuan

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to establish a protein two-dimensional electrophoresis system suitable for blueberry flower -bud, taking the dormantflower bud of 'Brigita', the main blueberry variety in Jizhou District of Tianjin as the test material, selectingfive protein samples volumes（2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00 mg）, two focusing voltages（8 000, 10 000 V）and three focusing times（6, 7, 8 h）for two-dimensional electrophoresis,the chromatographic patterns after R-250 Coomassie brilliant blue dyeingwere compared and analyzed.. The results showed that, when the sample volumes was 3.00 mg, the focusing voltage was 8000 V and the focusing time was 8 h, which can obtain a high resolution electrophoresis map with a large number of protein spots. A two- dimensional electrophoresis system suitable for blueberry dormant flower bud protein was established, which laysa foundation for the development of blueberry proteomics analysis, and providestheoretical basis and technical support for the study of molecular mechanism of blueberry flower bud dormancy and dormancy release.

blueberry; flower bud; protein; two-dimensional electrophoresis

1008-5394（2019）04-0016-04

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.004

S667.201

A

2019-05-05

天津市科學(xué)技術(shù)局項目（16YFZCNC00750）；天津市重大農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項目（2017CK0184）；天津市林果現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（ITTFPRS2018002）；天津市科技特派員項目（17ZXBFNC0031，18JCTPJC68000）

呂晨菲（1995-），女，碩士在讀，研究方向：果樹引種、栽培研究。E-mail：1787410311@qq.com。

楊靜慧（1961-），女，教授，博士，研究方向：園藝植物栽培、抗逆生理和分子育種研究。 E-mail：jinghuiyang2@aliyun.com。

責(zé)任編輯：楊霞