蘇云娟，陳鐵紅，卜立敏，申海靜，陳 雪，劉冰洋

作者單位：(110003)中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市，沈陽(yáng)愛爾眼視光醫(yī)院

0引言

圓錐角膜是一種較為常見的、漸進(jìn)性的、非炎癥性的雙眼角膜擴(kuò)張性疾病，角膜由于變薄和突出而呈圓錐形[1]。角膜擴(kuò)張性疾病導(dǎo)致角膜突出、散光、視力喪失，甚至可能導(dǎo)致穿孔。傳統(tǒng)的治療方法包括框架眼鏡、硬性透氣性角膜接觸鏡(RGPCL)、角膜基質(zhì)環(huán)植入等，但均無(wú)法阻止圓錐角膜進(jìn)展，約20%患眼最終需進(jìn)行角膜移植。角膜膠原交聯(lián)術(shù)(corneal collagen cross-linking，CXL)是利用核黃素(維生素B2)和紫外線A(ultraviolet A，UVA)之間的光氧化反應(yīng)來(lái)增加角膜纖維間的共價(jià)鍵，從而增加角膜硬度，延緩甚至阻止角膜膨隆的進(jìn)展[2]，其是一種相對(duì)較新的治療進(jìn)展性圓錐角膜的方法?；铙w共焦顯微鏡(IVCM)可在細(xì)胞層面上對(duì)角膜進(jìn)行活體研究，其提供了與體外組織化學(xué)方法相類似的圖像，特別適用于角膜細(xì)胞分析[3]。本研究的目的是評(píng)價(jià)CXL治療后角膜微結(jié)構(gòu)的變化，并利用IVCM分析角膜隨時(shí)間的改變情況。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2016-02/2017-02于我院行CXL術(shù)治療的進(jìn)展期圓錐角膜患者11例15眼，其中女5例7眼，男6例8眼，平均年齡31.0±14.1歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：確診為進(jìn)展期圓錐角膜，近1a內(nèi)屈光狀態(tài)增加≥1.00D，或角膜曲率增加≥1.00D，無(wú)其它影響視力的眼部疾病，愿意并能夠堅(jiān)持完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有可見的角膜瘢痕患者；(2)其它原因引起的角膜瘢痕、皰疹性角膜炎、嚴(yán)重干眼、角膜感染等眼部疾病者；(3)自身免疫性疾病者；(4)角膜厚度小于400μm。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且符合《赫爾辛基宣言》，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

圖1患者A手術(shù)前后角膜基底細(xì)胞IVCM圖像(×800)
A：術(shù)前，基底細(xì)胞大小和形態(tài)較均勻一致；B：術(shù)后1mo，基底細(xì)胞形態(tài)變異較大；C：術(shù)后3mo，基底細(xì)胞形態(tài)變異較大；D：術(shù)后6mo，基底細(xì)胞形態(tài)變異減??；E：術(shù)后12mo，基底細(xì)胞大小及形態(tài)趨于正常。

圖2不同患者手術(shù)前后角膜上皮下神經(jīng)纖維典型IVCM圖像(×800)
A：術(shù)前，可見上皮下神經(jīng)纖維扭曲、分支多；B：術(shù)后1mo，可見上皮下神經(jīng)纖維呈片段狀改變；C：術(shù)后3mo，未發(fā)現(xiàn)明顯神經(jīng)纖維，前彈力層呈條索狀改變；D：術(shù)后6mo，可見明顯的上皮下神經(jīng)纖維，但較稀疏；E：術(shù)后12mo，可見神經(jīng)纖維，但仍然較稀疏。

1.2方法

1.2.1手術(shù)方法術(shù)前所有患者均進(jìn)行最佳矯正視力、裂隙燈、電腦驗(yàn)光、眼壓、淚液分泌試驗(yàn)、角膜地形圖、共焦顯微鏡等檢查，排除手術(shù)禁忌證。術(shù)前眼表面麻醉2～3次，開瞼器開瞼，將角膜環(huán)放置于鞏膜表面，用9.0mm環(huán)鉆以角膜中央為中心刻痕，刮除此范圍的角膜上皮組織。向角膜滴1滴1g/L核黃素，使完全覆蓋角膜表面，至少2min一次，持續(xù)10min。大量無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈。對(duì)準(zhǔn)角膜區(qū)域，照射紫外線(總能量7.2J/cm2∶30mW/cm2)4min。照射結(jié)束后，配戴繃帶型角膜接觸鏡至角膜上皮完全愈合。術(shù)后術(shù)眼使用妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。

1.2.2IVCM檢查所有患者分別于術(shù)前和術(shù)后1、3、6、12mo進(jìn)行IVCM(HRT3)檢查，激光波長(zhǎng)670nm，放大倍率為800倍，水平分辨率為1μm，垂直分辨率為1μm，觀察視野400μm×400μm角膜的面積。檢查方法：待檢眼用5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉3次，在顯微鏡頭的前表面點(diǎn)1滴卡波姆滴眼液，將一次性無(wú)菌角膜接觸帽蓋于物鏡上，使接觸帽內(nèi)表面與物鏡表面通過(guò)凝膠相貼附。轉(zhuǎn)動(dòng)角膜顯微物鏡，直到屏幕中出現(xiàn)明亮的激光反射，設(shè)此時(shí)焦點(diǎn)位置的深度為0μm。調(diào)整IVCM頜托和前額托的位置，將受檢者的下頜與前額分別固定在下頜托與前額托上，并使受檢眼外眥與檢查標(biāo)記線對(duì)齊。旋轉(zhuǎn)調(diào)鈕前移物鏡，在前進(jìn)至靠近角膜表面時(shí)，調(diào)整物鏡位置，使掃描頭對(duì)準(zhǔn)角膜中心，囑受檢者盡量睜大眼，前移物鏡至角膜接觸帽觸及到受檢者的角膜，通過(guò)前后及水平轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡探頭位置，以獲得不同深度和不同層次的角膜細(xì)胞和神經(jīng)的圖像，IVCM掃描中央3～4mm范圍內(nèi)角膜，同時(shí)踩下按鈕，將圖像進(jìn)行保存，并選出每層中最清晰的2張圖片。上皮下神經(jīng)叢圖像定義為Bowman膜層水平第一個(gè)清晰的神經(jīng)叢圖像；前部基質(zhì)細(xì)胞層圖像定義為緊靠Bowman膜層后基質(zhì)的第一個(gè)清晰圖像；后部基質(zhì)細(xì)胞層圖像定義為緊靠?jī)?nèi)皮層之前基質(zhì)的第一個(gè)清晰圖像。使用Image J軟件分析上皮下神經(jīng)纖維密度，通過(guò)測(cè)量每幅圖像中神經(jīng)的總長(zhǎng)度計(jì)算上皮下神經(jīng)纖維密度。使用IVCM自帶分析軟件定量分析內(nèi)皮細(xì)胞密度和基質(zhì)細(xì)胞密度。每次檢查均由經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者進(jìn)行。

2結(jié)果

2.1 IVCM觀察角膜特點(diǎn)

2.1.1角膜上皮術(shù)前，本組患者角膜上皮層(表皮細(xì)胞層、翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞層)各層細(xì)胞大小及形態(tài)均正常。術(shù)后1mo可見角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)大小異常、形態(tài)不規(guī)則改變，而基底細(xì)胞越接近前彈力層方向細(xì)胞形態(tài)變異越大，可見片狀無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)。術(shù)后3mo表皮細(xì)胞形態(tài)幾乎接近正常，而基底細(xì)胞變異仍較大。術(shù)后6mo基底細(xì)胞形態(tài)變異減小。術(shù)后12mo基底細(xì)胞大小及形態(tài)趨于正常(圖1)。

2.1.2角膜上皮下神經(jīng)叢術(shù)前，本組患者角膜上皮下神經(jīng)表現(xiàn)為極度扭曲和神經(jīng)纖維分支多。術(shù)后1mo，7眼可見上皮下神經(jīng)片段，8眼未見任何上皮下神經(jīng)。術(shù)后3mo，10眼可見上皮下神經(jīng)片段，5眼未見任何上皮下神經(jīng)。術(shù)后6mo，12眼可見少量上皮下神經(jīng)纖維或神經(jīng)片段，3眼未見任何上皮下神經(jīng)。術(shù)后12mo，15眼均可見上皮下神經(jīng)纖維或神經(jīng)片段，但數(shù)量仍較少，未恢復(fù)到術(shù)前水平(圖2)。

圖3患者B手術(shù)前后角膜基質(zhì)IVCM圖像(×800)
圖A～C：術(shù)前，可見低反射微條紋的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；圖D～F：術(shù)后1mo，可見角膜前基質(zhì)呈蜂窩狀或網(wǎng)狀高反射改變，隨著深度的加深，這種結(jié)構(gòu)變化減少，幾乎未見基質(zhì)細(xì)胞核；圖G～I(xiàn)：術(shù)后3mo，蜂窩狀或網(wǎng)狀高反射結(jié)構(gòu)變化仍可見，基質(zhì)細(xì)胞核開始出現(xiàn)；圖J～L：術(shù)后6mo，蜂窩狀結(jié)構(gòu)明顯減少；圖M～O：術(shù)后12mo，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量幾乎恢復(fù)到術(shù)前水平，但前基質(zhì)仍可見反射增強(qiáng)，細(xì)條索狀改變。Z表示掃描深度。

圖4患者C手術(shù)前后角膜內(nèi)皮IVCM圖像(×800)
A：術(shù)前；B：術(shù)后1mo；C：術(shù)后12mo。

2.1.3角膜基質(zhì)術(shù)前，本組患者特征性基質(zhì)細(xì)胞在角膜前、中、后基質(zhì)中均可見，基質(zhì)中可見低反射微條紋的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。CXL術(shù)后，角膜基質(zhì)發(fā)生了顯著變化。術(shù)后1mo，角膜基質(zhì)呈蜂窩狀或網(wǎng)狀高反射結(jié)構(gòu)，幾乎未見典型高反射基質(zhì)細(xì)胞，這種顯著的結(jié)構(gòu)變化在前部和中部基質(zhì)中可見，隨著深度的加深，這種結(jié)構(gòu)變化減少。術(shù)后3mo，上述結(jié)構(gòu)變化仍然可見，僅見少量基質(zhì)細(xì)胞。術(shù)后6mo，角膜基質(zhì)蜂窩狀結(jié)構(gòu)明顯減少，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量仍較少。術(shù)后12mo，前部基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量幾乎恢復(fù)到術(shù)前水平，但前部基質(zhì)仍可見反射增強(qiáng)，細(xì)條索狀改變。術(shù)后隨訪觀察后部角膜基質(zhì)細(xì)胞一直未受明顯影響。約1/2病例基質(zhì)中可見細(xì)長(zhǎng)針狀結(jié)構(gòu)，隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，這種改變未見明顯減少(圖3)。

2.1.4角膜內(nèi)皮手術(shù)前后，本組患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞大小和形態(tài)均未見明顯變化(圖4)。

2.2手術(shù)前后角膜上皮下神經(jīng)纖維、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞密度的比較本組患者不同時(shí)間點(diǎn)角膜上皮下神經(jīng)纖維密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.529，P<0.05)，術(shù)后1、3、6、12mo角膜上皮下神經(jīng)纖維密度與術(shù)前相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.092、3.982、2.403、1.540，均P<0.05)。不同時(shí)間點(diǎn)角膜前部基質(zhì)細(xì)胞密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.014，P<0.05)，其中術(shù)后1、3、6mo角膜前部基質(zhì)細(xì)胞密度與術(shù)前相比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.932、6.125、3.431，均P<0.05)，術(shù)后12mo角膜前部基質(zhì)細(xì)胞密度與術(shù)前相比略降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.382，P=0.708)。不同時(shí)間點(diǎn)角膜后部基質(zhì)細(xì)胞密度和內(nèi)皮細(xì)胞密度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.707、0.651，均P>0.05)，見表1。

2.3不良反應(yīng)情況隨訪期間，本組患者均未出現(xiàn)任何與治療相關(guān)的不良反應(yīng)或角膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷，IVCM檢查后均未出現(xiàn)角膜并發(fā)癥。

時(shí)間上皮下神經(jīng)纖維(mm/mm2)前部基質(zhì)細(xì)胞(個(gè)/mm2)后部基質(zhì)細(xì)胞(個(gè)/mm2)內(nèi)皮細(xì)胞(個(gè)/mm2)術(shù)前19.72±4.61421.8±102.5220.1±37.12701±93.0術(shù)后1mo2.23±3.531.2±10.1211.8±47.02700±90.3術(shù)后3mo5.39±5.9774.3±51.2221.2±39.82693±74.2術(shù)后6mo8.22±6.20209.5±45.9222.6±21.472708±92.6術(shù)后12mo12.58±6.17418.9±93.1228.0±42.972698±105.4 F3.5295.0140.7050.651P0.0240.010.4040.970

3討論

利用核黃素和紫外線進(jìn)行CXL最早是由Spoerl等[4]提出來(lái)的，CXL可以增加角膜組織硬度。CXL被認(rèn)為是唯一一種可以延緩或阻止進(jìn)展性圓錐角膜發(fā)展的“病理性方法”[5]。本研究中，我們應(yīng)用IVCM觀察CXL術(shù)后角膜各層細(xì)胞發(fā)生的變化。之前國(guó)內(nèi)也有關(guān)于應(yīng)用IVCM觀察CXL術(shù)后角膜改變的相關(guān)報(bào)道[6]，本研究主要側(cè)重于對(duì)CXL術(shù)后角膜各層細(xì)胞變化的觀察，這在國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。

理論上，在深度超過(guò)300μm時(shí)紫外線能量及氧自由基均已不足,這樣可以確保CXL對(duì)角膜內(nèi)皮產(chǎn)生的損傷最小[7]。本組患者術(shù)后1～12mo隨訪中，角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量均未見明顯改變，這與既往研究結(jié)果類似的[8-10]。CXL術(shù)中角膜上皮被刮除，故術(shù)后常引起疼痛。術(shù)后給予配戴繃帶型角膜接觸鏡，疼痛癥狀有所緩解。術(shù)后1mo時(shí)角膜上皮已經(jīng)完全愈合，我們行IVCM檢查發(fā)現(xiàn)術(shù)后1mo表皮細(xì)胞、翼狀細(xì)胞、基底細(xì)胞出現(xiàn)大小異常、形態(tài)不規(guī)則。隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，我們發(fā)現(xiàn)這種形態(tài)異常逐漸減小，直到術(shù)后3mo，表皮細(xì)胞形態(tài)幾乎接近正常，而基底細(xì)胞變化較大，越接近前彈力層方向細(xì)胞形態(tài)變異越大，可見片狀無(wú)細(xì)胞結(jié)構(gòu)區(qū)。分析可能與CXL術(shù)主要作用于角膜膠原纖維有關(guān)，越靠近前彈力層，膠原纖維越密集，故基底細(xì)胞損傷越重，但是確切病理機(jī)制有待進(jìn)一步研究。術(shù)后12mo基底細(xì)胞大小及形態(tài)趨于正常，表明CXL術(shù)對(duì)角膜上皮的影響是可以恢復(fù)的[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，CXL術(shù)后1、3、6mo角膜上皮下神經(jīng)纖維顯著減少或完全消失，直到術(shù)后12mo，角膜上皮下神經(jīng)纖維仍然稀疏，未達(dá)到術(shù)前水平。本研究結(jié)果與Jordan等[8]研究結(jié)果相似，該研究選取38例圓錐角膜患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXL術(shù)后1mo時(shí)上皮下神經(jīng)缺損率為71%，術(shù)后3mo時(shí)為55%，術(shù)后6mo時(shí)為18%，術(shù)后12mo時(shí)為7%，相互連接的神經(jīng)纖維未形成之前表現(xiàn)為片段狀。Knappe等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CXL術(shù)后4mo時(shí)可以檢測(cè)到角膜上皮下神經(jīng)。這與本研究結(jié)果略有差別，分析可能與術(shù)后隨訪時(shí)間不同有關(guān)。Alessio等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CXL術(shù)后18mo角膜上皮下神經(jīng)纖維逐漸達(dá)到術(shù)前水平，直到術(shù)后4a，趨于穩(wěn)定，這與本研究結(jié)果相似。說(shuō)明上皮下神經(jīng)的恢復(fù)需要更長(zhǎng)的時(shí)間。研究表明，CXL術(shù)后早期階段(2～4wk)中央角膜上皮下神經(jīng)纖維完全消失[11，12-14]，而在隨后的12～24mo上皮下神經(jīng)逐漸再生[13-14]。上述變化也說(shuō)明CXL術(shù)后早期角膜敏感性降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，CXL術(shù)后早期角膜上皮下神經(jīng)密度降低，這種情況也同樣發(fā)生在準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(PRK)術(shù)后[15]。PRK術(shù)后4wk上皮下神經(jīng)纖維開始再生，術(shù)后12mo仍未恢復(fù)到術(shù)前水平，術(shù)后24mo恢復(fù)到術(shù)前水平[16-17]。這與CXL術(shù)后上皮下神經(jīng)再生的過(guò)程相似，然而目前還不清楚角膜上皮下神經(jīng)纖維的缺失是由于角膜上皮損傷和核黃素/UVA治療引起的，還是CXL術(shù)后早期角膜水腫IVCM不能觀察到上皮下神經(jīng)纖維導(dǎo)致[8]。

CXL術(shù)后早期最大的變化發(fā)生在基質(zhì)層，特別是前、中基質(zhì)層，典型表現(xiàn)為基質(zhì)細(xì)胞消失，取而代之的是蜂窩狀或網(wǎng)狀高反射結(jié)構(gòu)，主要累積于前、中部基質(zhì)。本研究術(shù)后1mo前基質(zhì)中幾乎未見基質(zhì)細(xì)胞，與Knappe等[11]研究結(jié)果相一致。而Mohammad-Naeim等[10]發(fā)現(xiàn)46%患者術(shù)后1mo未發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細(xì)胞，而54%患者可以發(fā)現(xiàn)少量基質(zhì)細(xì)胞。既往研究表明，CXL術(shù)后早期，前部基質(zhì)呈蜂窩狀水腫，幾乎所有前基質(zhì)細(xì)胞均發(fā)生凋亡，類似于PRK術(shù)后[18]。我們研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3mo時(shí)可見前基質(zhì)出現(xiàn)少量基質(zhì)細(xì)胞，與相關(guān)研究基本一致，表明CXL術(shù)后2～3mo角膜基質(zhì)細(xì)胞開始修復(fù)[11-13]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后6mo基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量未恢復(fù)到術(shù)前水平，并且前部基質(zhì)仍可見反射增強(qiáng)，細(xì)條索狀改變，并且隨著隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，到術(shù)后12mo前部基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量基本達(dá)到術(shù)前水平，這與Mohammad-Naeim等[10]研究結(jié)果一致。Jordan等[8]發(fā)現(xiàn)術(shù)后1mo時(shí)86%角膜基質(zhì)細(xì)胞完全消失，術(shù)后1、3mo可以觀察到散在的基質(zhì)細(xì)胞，術(shù)后6mo基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，術(shù)后12mo達(dá)到正常水平，這與本研究結(jié)果相似。前部基質(zhì)水腫及基質(zhì)細(xì)胞凋亡是由于上皮層、Bowman層、前部基質(zhì)層損傷所致，但是目前的體外研究證實(shí)，相比單獨(dú)使用紫外線引起前部基質(zhì)細(xì)胞凋亡，CXL引起細(xì)胞凋亡會(huì)更嚴(yán)重[13]。

本研究中，CXL術(shù)后后基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量不受影響，這一結(jié)論與之前的研究結(jié)果一致[11，13-14]。另外，有研究報(bào)道，術(shù)后1mo時(shí)中部基質(zhì)呈高反射帶，這個(gè)區(qū)域內(nèi)角膜基質(zhì)細(xì)胞變成細(xì)長(zhǎng)針狀結(jié)構(gòu)，呈高反射，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，這種結(jié)構(gòu)逐漸消失，術(shù)后1a 60%患者存在細(xì)長(zhǎng)的基質(zhì)細(xì)胞，47%患者存在高反射帶[8]。這些結(jié)構(gòu)被假設(shè)為新合成的膠原，可能為活化角膜基質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)物[9，11，13]。Kymionis等[19]注意到這種細(xì)長(zhǎng)針狀結(jié)構(gòu)在隨訪過(guò)程中會(huì)發(fā)生從后基質(zhì)到前基質(zhì)的移位。最近的體外研究也表明，這種結(jié)構(gòu)與短暫的角膜成纖維細(xì)胞生成有關(guān)，具有異常上皮基底膜的角膜會(huì)產(chǎn)生肌成纖維細(xì)胞，形成永久的haze或瘢痕[17，20-21]。

綜上，本研究應(yīng)用IVCM觀察發(fā)現(xiàn)CXL術(shù)后早期角膜上皮下神經(jīng)纖維顯著減少或消失，前部基質(zhì)層基質(zhì)細(xì)胞幾乎完全凋亡及基質(zhì)水腫，后部基質(zhì)層及內(nèi)皮細(xì)胞層不受累；術(shù)后12mo，基質(zhì)細(xì)胞幾乎達(dá)到術(shù)前水平，而角膜上皮下神經(jīng)纖維未達(dá)到術(shù)前水平，還需要更長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)。此外，由于本研究納入樣本過(guò)少，故仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，延長(zhǎng)術(shù)后觀察時(shí)間，進(jìn)行更深入的研究。