徐建坤，張 旺，肖 婧，程衛(wèi)東，史學(xué)偉*

（1.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學(xué) 信息科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

紅提葡萄果實(shí)大而飽滿(mǎn)、甜度高、營(yíng)養(yǎng)豐富、果皮略厚、不易脫粒[1]，營(yíng)養(yǎng)十分豐富[2]，因而自釀葡萄酒備受人們歡迎[3]。酵母菌主要在無(wú)氧條件下進(jìn)行繁殖，在有氧條件下將糖發(fā)酵成酒精和二氧化碳，是一種典型的兼性厭氧微生物，遍布于整個(gè)自然界[4-5]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，酵母菌不僅是發(fā)酵劑，而且會(huì)影響葡萄酒的品質(zhì)、產(chǎn)量以及香氣等[6-7]。由于與葡萄酒中的花青素發(fā)生反應(yīng)，酵母產(chǎn)生的β-D-糖苷酶和酵母代謝產(chǎn)物丙酮酸、乙醛導(dǎo)致酒體中單體花青素降解，從而改變葡萄酒的顏色特征[7]。不同品種、地區(qū)葡萄自身所帶酵母菌的不同，不同酵母菌發(fā)酵所產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物的不同，以及釀造過(guò)程的發(fā)酵工藝及發(fā)酵環(huán)境的不同等諸多因素的影響下使得由天然酵母進(jìn)行發(fā)酵所釀造的葡萄酒具有較為獨(dú)特的地方特色[8-9]。在酒精發(fā)酵中，酵母菌是主力軍，但不是所有的酵母菌都是有利于葡萄酒發(fā)酵的進(jìn)行的，因此，研究酵母菌的多樣性也是有助于避免敗壞性酵母的識(shí)別[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅提葡萄：從新疆石河子地區(qū)采摘。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂、乙醇、檸檬酸、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硫酸銨、硝酸鉀、尿素、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、酵母膏、酵母菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取試劑盒、溶壁酶、2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ddH2O、Ladder Marker、DNA擴(kuò)增引物（ITS）：上海生工生物技術(shù)有限公司。以上試劑均為分析純或生化試劑。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextros，YEPD）培養(yǎng)基、WL瓊脂培養(yǎng)基、同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化碳源液體培養(yǎng)基、同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、同化氮源液體培養(yǎng)基：上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B生化培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司；DYY-8C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T100PCR儀、GelDOC XR凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)BioRad公司；CX21FS1光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S全自動(dòng)高壓滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Bnp-9272智能生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；B250恒溫水浴鍋：上海予卓?jī)x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

紅提葡萄中酵母菌的分離：取10顆紅提葡萄經(jīng)破碎后放于裝有100 mL YEPD液體培養(yǎng)基（提前滅菌）的250 mL錐形瓶中并搖勻。28℃搖床培養(yǎng)24 h，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為180 r/min，富集培養(yǎng)結(jié)束后去5 mL培養(yǎng)液作為菌株分離的樣品。

1.3.2 菌株的分離純化

用1mL移液槍吸取1 mL培養(yǎng)液于9 mL無(wú)菌水試管中，振蕩混勻，標(biāo)記為10-1稀釋度，用1 mL移液槍吸取1 mL 10-1稀釋度的培養(yǎng)液于9 mL無(wú)菌水試管中，標(biāo)記為10-2稀釋度，依次稀釋7個(gè)梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用200 μL移液槍吸取200 μL菌液于YEPD固體培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行涂布，每個(gè)稀釋梯度平行涂布3個(gè)平板，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取YEPD固體培養(yǎng)基中不同形態(tài)、不同大小的菌落在YEPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(xiàn)，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，經(jīng)多次劃線(xiàn)純化得到單一菌落。

1.3.3 WL培養(yǎng)基表型鑒定及菌株形態(tài)觀(guān)察

根據(jù)培養(yǎng)基上菌落的大小、顏色、光澤、形狀等表型的差異，對(duì)供試菌株進(jìn)行初步分類(lèi)并且挑選出代表菌株，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微形態(tài)觀(guān)察，采集顯微觀(guān)察照片。

將分離菌株劃線(xiàn)接種于WL培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀(guān)察菌落形態(tài)及顏色，根據(jù)菌落形態(tài)及顏色對(duì)所分離酵母菌進(jìn)行初步分類(lèi)。

1.3.4 生理生化試驗(yàn)

分離酵母菌的生理生化試驗(yàn)主要包括：糖發(fā)酵試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)以及碳源同化試驗(yàn)[12]。

（1）酵母菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)：將各種種類(lèi)的糖（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖）加入0.6%的酵母浸粉溶液中，使糖含量達(dá)到2%，然后將配制好的溶液分別加入含有杜氏發(fā)酵管的試管中，接入活化的供試菌株，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)過(guò)程中，若杜氏管頂部出現(xiàn)氣泡，則說(shuō)明供試菌株可以利用此種糖，此時(shí)可記為“+”（陽(yáng)性反應(yīng)），若無(wú)變化，記為“-”（陰性反應(yīng)）。

（2）氮源同化試驗(yàn)：將處于生長(zhǎng)期的供試菌株接入氮源液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀(guān)察生長(zhǎng)情況和溶液變化情況，并與空白試驗(yàn)對(duì)照，觀(guān)察溶液是否發(fā)生渾濁，是否形成環(huán)島和菌璞等。

（3）碳源同化試驗(yàn)：將處于生長(zhǎng)期的供試菌株接入碳源液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀(guān)察生長(zhǎng)情況和溶液變化情況，并與空白試驗(yàn)對(duì)照，觀(guān)察溶液是否發(fā)生渾濁，是否形成環(huán)島和菌璞等。

1.3.5 菌種的保藏

在酵母菌劃線(xiàn)平板中挑取單菌落于裝有10 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用1 mL移液槍吸取0.75 mL經(jīng)滅菌體積分?jǐn)?shù)為甘油于1.5 mL離心管中，冷藏備用。將培養(yǎng)菌液與60%的滅菌甘油1∶1混合，-70℃保藏。

1.3.6 DNA的提取

通過(guò)離心收集菌體后按照BioFlux真菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明提取DNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量，提取的DNA放置在-20℃環(huán)境中保存，以避免DNA降解。

1.3.7 PCR擴(kuò)增

使用上述方法提取的酵母菌DNA樣品2 μL為擴(kuò)增模板，引物ITS12μL，引物ITS42μL，ddH2O19μL，Mix25μL，空白不加樣品，ddH2O21μL。擴(kuò)增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR擴(kuò)增程序：94℃變性1 min，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)[13]。

1.3.8 PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

將3μLPCR產(chǎn)物點(diǎn)樣到1%瓊脂糖凝膠（已加入染色液）的點(diǎn)樣孔中，電壓110V，電流90mA，時(shí)間約30min。用凝膠成像儀觀(guān)察電泳結(jié)果，將合格的PCR反應(yīng)產(chǎn)物送檢。

1.3.9 PCR產(chǎn)物測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將電泳檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后將測(cè)序基因進(jìn)行拼接，然后使用美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行測(cè)序菌株的同源性比對(duì)，獲得同源酵母標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列后，使用ClustalW程序?qū)⒕晷蛄羞M(jìn)行匹配排列，然后結(jié)合軟件Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分離、純化及在WL培養(yǎng)基上的形態(tài)分類(lèi)[14-15]

通過(guò)YEPD液體培養(yǎng)基的富集及YEPD固體培養(yǎng)基的分離和純化，一共從紅提葡萄中分離純化和保藏得到24個(gè)酵母菌菌株，編號(hào)為Y-1～Y-24。

由表1可知，通過(guò)對(duì)酵母菌在WL培養(yǎng)基菌落形態(tài)的觀(guān)察，初步判斷菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24為同一屬，菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19為同一屬，其他菌株還不能判斷。

觀(guān)察24株酵母菌分離株菌落形態(tài)，菌落形態(tài)幾乎為圓形或橢圓形；顏色大多為白色或者淡黃色，個(gè)別菌落為淡紅色。通過(guò)對(duì)分離得到的24株酵母菌進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察，并對(duì)這些菌株進(jìn)行初步的分類(lèi)和歸納，24株酵母菌大概分為3個(gè)類(lèi)別，其菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)如圖1所示。

表1 酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Table1 Morphology of yeasts on WL medium

圖1 酵母菌菌落形態(tài)（A）和個(gè)體形態(tài)（B）Fig.1 Colonial morphology(A)and individual morphology(B)of yeasts

2.2 生理生化分析

2.2.1 糖發(fā)酵試驗(yàn)

由表2可以看出，24株酵母菌均可以利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，都不可以利用蔗糖、麥芽糖和乳糖進(jìn)行發(fā)酵。

表2 24株酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of sugar fermentation tests of 24 yeasts

2.2.2 氮源同化試驗(yàn)

表3 24株酵母菌氮源同化試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of nitrogen source assimilation tests of 24 yeasts

續(xù)表

由表3可知，所有菌株都不可同化尿素和硝酸鉀，都可同化硫酸銨。

2.2.3 碳源同化試驗(yàn)

表4 24株酵母菌碳源同化試驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of carbon source assimilation tests of 24 yeasts

由表4可知，除了菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19可同化蔗糖，其余菌株都不可同化蔗糖。其他菌株都能夠同化乙醇和檸檬酸為碳源。所有的菌株都不能同化可溶性淀粉。

結(jié)合表1～3可以看出，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-22均可發(fā)酵葡萄糖，不可發(fā)酵蔗糖、乳糖與麥芽糖；在氮源同化試驗(yàn)中均可同化硫酸銨，不可同化硝酸銨和尿素；在碳源同化試驗(yàn)中都可同化乙醇和檸檬酸，不可同化蔗糖和可溶性淀粉；可初步判斷為畢赤酵母屬。其余菌株目前不能判斷。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 酵母菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

將提取的酵母菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在500～600 bp出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增條帶，且條帶較為明亮，在酵母菌的理論預(yù)期值之內(nèi)，PCR擴(kuò)增結(jié)果符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行測(cè)序。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2 26S rDNA D1/D2區(qū)域PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis results of PCR amplification products for 26S rDNA D1/D2 region

2.3.2 酵母菌DNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果

本試驗(yàn)分離出的24株酵母菌測(cè)序結(jié)果使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast程序調(diào)用Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇同源性最高的菌株，比對(duì)結(jié)果如表5所示。

表5 24株酵母菌同源性比較及登錄號(hào)Table5 Homology comparison and registration numbers of 24 yeasts

續(xù)表

2.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

圖3 紅提葡萄酵母ITS序列區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of ITS sequence region of yeast from red grape

由圖3可知，菌株Y-1、Y-5、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-14、Y-15、Y-16、Y-17、Y-18、Y-20、Y-22、Y-23的ITS區(qū)序列在進(jìn)化關(guān)系上親緣關(guān)系較近，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上形成了第一類(lèi)群，屬于畢赤酵母屬（Pichia）。菌株Y-2、Y-3、Y-6、Y-19的ITS區(qū)序列在進(jìn)化關(guān)系上親緣關(guān)系較近，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上形成了第二類(lèi)群，屬于梅奇酵母屬（Metschnikowia）。菌株Y-4、Y-13、Y-21、Y-24的ITS區(qū)序列與漢遜酵母屬（Hanseniaspora）在進(jìn)化關(guān)系上親緣關(guān)系較近，形成第三類(lèi)群。

結(jié)合圖3和表5可得，畢赤酵母屬占所有酵母菌的66.67%，分離所得24株酵母菌中有12株為庫(kù)德畢赤酵母，占比為50%，其次是葡萄汁有孢漢遜酵母和梅奇酵母，占比都是16.67%。所有分離株與相對(duì)應(yīng)的參考菌株同源性都達(dá)到了98%以上，并與其聚在一起，證明酵母菌ITS區(qū)域序列分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[16-20]。分離酵母菌株基因鑒定結(jié)果與表型鑒定結(jié)果、生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果基本一致。

3 討論

紅提葡萄是一種鮮食葡萄，它的含糖量在17%左右，相較于釀酒葡萄的含糖量較低，這與釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的條件有著天然的差距，也因此人們對(duì)于其酵母菌多樣性的研究較少。賈春鳳等[2]主要研究了紅提葡萄在發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌及其耐受性和發(fā)酵能力，篩選出了具有較好耐受性的菌株。黃靜等[26]研究了鮮食葡萄紅提和戶(hù)太八號(hào)的釀酒特性，對(duì)總酚、單體酚和花色苷在不同貯藏條件下的變化情況進(jìn)行了詳細(xì)闡述；而都晗等[27]則將鮮食葡萄戶(hù)太八號(hào)、夏黑和釀酒葡萄愛(ài)格麗、嘉年華、玫瑰香進(jìn)行起泡葡萄酒的釀造，得出愛(ài)格麗及夏黑釀造的起泡葡萄酒品質(zhì)較高。這說(shuō)明在葡萄酒的釀造中，鮮食葡萄也有自己的可取之處。

而本研究沿著前人的思路進(jìn)一步將分離所得的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)來(lái)闡述紅提葡萄中酵母菌的多樣性，從而發(fā)掘紅提葡萄所蘊(yùn)含的酵母菌資源。

另一方面，發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌除了添加的人工酵母和葡萄所攜帶的野生酵母還可以來(lái)自酒廠(chǎng)機(jī)械環(huán)境，發(fā)酵酵母的多樣可以使葡萄酒的風(fēng)味多樣[21-24]，因此進(jìn)行酵母菌多樣化的研究是有重要意義的。

今后開(kāi)展紅提葡萄酵母菌多樣性的研究可從紅提葡萄園的土壤中分離本土化酵母菌群也可選取不同地區(qū)的紅提葡萄分離酵母菌群，并對(duì)其中參與葡萄酒釀造的酵母菌進(jìn)行深入研究，從而選育具有地區(qū)特色的酵母菌，為我國(guó)葡萄酒釀造產(chǎn)業(yè)服務(wù)，為紅提葡萄表皮酵母菌資源的開(kāi)發(fā)與利用服務(wù)。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)石河子紅提葡萄酵母菌的篩選、純化、提取DNA，對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送檢利用分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合表型鑒定得到24株酵母菌，最終被鑒定為3個(gè)屬，分別為漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、梅奇酵母屬（Metschnikowia）。5個(gè)不同種群，分別為庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、梅奇酵母（Metschnikowia）。并且?guī)斓庐叧嘟湍笧閮?yōu)勢(shì)酵母菌群。