周建弟，張 蕾，錢 斌，蔣予箭*，鄒慧君，李智慧，王 蘭

（1.國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興 312000；2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興 312000；3.浙江工商大學 食品與生物技術學院，浙江 杭州 310012）

黃酒是中國特有的釀造酒，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大發(fā)酵酒。黃酒發(fā)酵方式屬于雙邊發(fā)酵且伴隨著多種微生物共同發(fā)酵，特定的發(fā)酵工藝使黃酒具有獨特的風味特征以及特定的功能性。隨著生活水平的不斷提高，消費者的需求目標已向健康保健轉變，單純的酒種已不能滿足消費者的需要。研究表明[1-2]，黃酒中吡嗪類、核苷類、黃酮類、萜烯類化合物等比較豐富，此外黃酒中游離氨基酸、功能性低聚糖、礦物質元素和多酚類物質含量要明顯優(yōu)于其他酒類。黃酒是富含功能性低聚糖的天然飲品，功能性低聚糖具有多種重要的生理功能，因此適量飲用黃酒能起到較好的保健作用[3]。黃酒中富含γ-氨基丁酸，具有提高記憶力、降血壓、活化肝腎及防止動脈硬化等功能[4]。

功能性黃酒就是指在生產(chǎn)過程中添加功能因子后制成的一類黃酒，對人體有一定的保健功能[5]。楊祖滔[6]研究表明，薏米茯苓黃酒中含有豐富的功能性成分，具有較強的抗氧化能力。此外，紅曲黃酒[7]、桑葚黃酒[8]、牡蠣黃酒[9]等新型的功能性黃酒得以被開發(fā)，這些新型黃酒適量飲用能夠改善機體免疫力。閆訓友等[10]研究富含冬蟲夏草發(fā)酵液中蟲草素的功能性黃酒。趙貝等[11]研究阿魏藥酒表明，抗腫瘤作用可能與其免疫調節(jié)和抗氧化作用有關。李鴻儒等[12]研究附子藥酒表明，附子藥酒雖有一定抗腫瘤作用，但同時對阻止腫瘤生長也有不利的方面。近年來富含中草藥成分的黃酒也被開發(fā)出來，許多學者對黃芪甲苷和三七[13-14]、麥冬[15-16]、甘草[17]、五味子[18]等進行了大量研究，表明這些中草藥對提高人體免疫力方面具有很大的作用。因此，功能性黃酒的開發(fā)具有很大的前景。

但是具有功能性的黃酒，其功能性表現(xiàn)尚不明確。因此本研究以低度傳統(tǒng)半干紹興黃酒為酒基，加入黃芪、麥冬、五味子、生曬參、甘草中藥提取物，增加皂苷、多糖等功能性成分含量，通過建立不同的小鼠免疫抑制模型，對小鼠進行功能性黃酒的處理，以說明功能性黃酒對提高機體免疫力的作用，為開發(fā)新型的功能性黃酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥材（黃芪、五味子、生曬參、麥冬、甘草）：杭州東仁堂醫(yī)藥零售十號大街店；清潔級美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（體質量（20±2）g）：浙江醫(yī)學科學院動物中心；紹興黃酒（酒精度15%vol）：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；環(huán)磷酰胺：上海生工生物工程股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒：上海邦奕生物科技有限公司；細胞裂解液：國家黃酒工程技術中心；磷酸緩沖液：國家黃酒工程技術中心。

1.2 儀器與設備

BW3200S電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；5910R高速冷凍離心機：艾本德中國有限公司；BD FACSCalibur流式細胞儀：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；DFY-200C小型粉碎機：上海利聞科學儀器有限公司；FE30 pH計：瑞士梅特勒-托利多集團。

1.3 實驗方法

1.3.1 功能性黃酒制作

將實驗用中藥材在40℃烘干至恒質量，將其粉碎至40目大小均勻顆粒。稱取黃芪20 g、五味子4 g、生曬參20 g、麥冬8 g、甘草8 g，將藥材以1∶1.5（g∶mL）的料液比，利用體積分數(shù)為75%的乙醇在37℃條件下浸提12 h，并在70℃的條件下回流5h，經(jīng)過濾、在溫度50℃條件下進行真空濃縮，用紹興黃酒作為酒基，用浸提液勾兌成8度的功能性黃酒，測定功效成分含量，并進行試驗。

1.3.2 小鼠建模實驗

將小鼠飼養(yǎng)在潔凈的環(huán)境中，環(huán)境溫度穩(wěn)定在（22±2）℃，保持12 h的白天和夜晚循環(huán)飼養(yǎng)，經(jīng)過1周的適應性飼養(yǎng)后進行相關的免疫學實驗。取60只ICR小鼠，12只一組進行實驗。

建模組和給藥組小鼠進行環(huán)磷酰胺[19-20]建模處理，模型1：腹腔注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質量，連續(xù)注射3 d，在試驗的第11、12、13天，皮下注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質量。在試驗的第21、22、23天后再強化一次，即皮下注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質量。模型2：腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量40 mg/kg體質量連續(xù)7 d，停用環(huán)磷酰胺3 d，然后再用以同樣的方法強化（即腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量40 mg/kg體質量連續(xù)7 d，停用環(huán)磷酰胺3 d）。

給藥實驗，于環(huán)磷酰胺實驗處理后分別于第9、10、11天和第19、20、21天后再強化一次。每周稱質量一次，記錄死亡情況。按體質量進行給藥（功能性黃酒喂食），各組給藥劑量為小鼠體質量×10 mL/kg，給藥30 d。

1.3.3 分析檢測

（1）小鼠體質量的測定

通過對不同實驗組進行處理，每星期對小鼠進行稱質量，記錄試驗數(shù)據(jù)。

（2）小鼠免疫器官的測定

末次給藥24 h后，脊椎脫臼處死小鼠，及時取出小鼠的胸腺、脾臟、腎臟、肝臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干水分，進行稱質量，按下列公式計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)：

式中：I為胸腺指數(shù)/脾臟指數(shù)/腎臟指數(shù)/肝臟指數(shù)；W1為胸腺/脾臟/腎臟/肝臟質量，mg；W0為小鼠體質量，g。

（3）小鼠血漿中免疫球蛋白M含量測定

動物眼眶采血，放在非抗凝血試管中，室溫靜置2 h后，2 500 r/min離心10 min，取上清，測定免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）。采用ELISA法進行測定，具體操作均按照試劑盒說明書處理。

（4）小鼠血漿中T細胞分型的測定

動物眼眶采血，放在抗凝血試管中，按說明書處理后，流式細胞儀測定T淋巴細胞亞細胞群分化簇3（cluster of differentiation3，CD3）、分化簇 4（cluster of differentiation 4，CD4），分化簇 8（cluster ofdifferentiation8，CD8）。具體步驟如下：取500 μL血漿至細胞流式管，加入2 mL紅細胞裂解液，靜置10 min，然后加入磷酸鹽緩沖液至流式管頂部，2 000 r/min離心10 min。棄去上清液，再次加入2 mL紅細胞裂解液，靜置10 min，然后加入磷酸鹽緩沖液至流式管頂部，2 000 r/min離心10 min?？醇t細胞裂解程度，是否需要再次裂解。全程放在低溫環(huán)境中操作。最后一次棄去上清液，沉淀加入100微升磷酸鹽緩沖液，各加10 μLCD3、CD4、CD8鼠抗人熒光單克隆抗體，4℃避光放置30 min。然后加入磷酸緩沖液至流式管刻度稍微以下，2 000 r/min離心10 min。離心結束后，棄去上清液，再加入100 μL的磷酸緩沖液。通過熒光單克隆抗體對組織細胞內(nèi)抗原進行定性、定量，在流式細胞儀上計數(shù)1×105個/kg以上細胞，分別記錄T淋巴細胞（CD3+），輔助誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+），抑制細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD8+）以及T輔助細胞/T抑制細胞（CD4+/CD8+）表達的陽性率。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin 8.5軟件、Excel和SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行作圖和差異顯著性分析。所有的數(shù)據(jù)都以“平均值±標準偏差”表示，P＜0.05時表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 功能性黃酒成分

功能性黃酒是指以黃酒為基酒，通過添加特定中草藥成分的萃取濃縮液而形成的一種新型黃酒，使其能夠增強機體免疫力，改善人體亞健康，但不以治療為目的[5]。黃芪、麥冬、甘草、生曬參、五味子均記載于《中國藥典》[21]，且允許用于保健食品。通過《中國藥典》推薦攝入量查詢以及問詢中醫(yī)，確定了功能性黃酒的基本配方見表1。

表1 人體推薦攝入量和功能性黃酒配方Table1 Recommended intake and functionalHuangjiuformula

依據(jù)表1功能性黃酒配方，對該功能性黃酒中的功效成分進行檢測，通過已有的檢測方法[22-25]，進行總皂苷、總多糖、總多酚、總黃酮的含量測定，結果見表2。

表2 功能性黃酒中功效成分含量Table2 Content of functional components in functionalHuangjiu

由表2可知，功能性黃酒中含有皂苷、多糖、多酚及黃酮等功效成分。

2.2 小鼠建模結果

通過環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑建立免疫抑制模型的實驗方法，對小鼠進行建模處理，建立不同的免疫抑制模型以驗證不同處理組的免疫提升效果，建模結果見表3。

表3 小鼠建模及處理方法Table3 Modeling and treatment methods of mice

由表3可知，空白對照組：8度空白黃酒；模型組1：在造?；A上，喂食8度空白黃酒；模型組2：在造模基礎上，喂食8度空白黃酒；給藥組1（模型組1+藥物）：在造?；A上，喂食藥酒。藥酒酒精度8度，生藥量0.91 g/mL；給藥組2（模型組1+藥物）：在建模基礎上，喂食藥酒。藥酒酒精度8度，生藥量0.91 g/mL。

2.3 不同造模模型對小鼠體質量的影響

小鼠體質量變化是小鼠免疫力的最直觀的體現(xiàn)。實驗30 d后，對實驗小鼠進行稱質量，每周小鼠的體質量變化見表4。

由表4可知，從第二周開始造模組小鼠的體質量均低于空白組小鼠體質量，存在顯著性差異（P＜0.05），說明通過環(huán)磷酰胺處理，小鼠的免疫功能遭到抑制，實驗建模成功。對比給藥1組和給藥2組可知，在給藥1組的條件下，免疫恢復效果要好于給藥2組。且給藥2組與模型組相比，體質量反而減少，可能是由于模型2組造模程度太深，這與宋雁等[19]研究結果相似。

表4 不同建模模型對小鼠體質量的影響Table4 Effects of different modeling models on body mass of mice

2.4 不同建模模型對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是與免疫相關的主要臟器指數(shù)[26-27]。實驗30 d后，對小鼠進行解剖，取下小鼠的脾臟、胸腺、肝臟和腎臟進行稱質量，結果分別見圖1和圖2。

圖1 不同建模模型對小鼠胸腺和肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different modeling models on thymus and liver indexes of mice

圖2 不同建模模型對小鼠腎臟與脾臟指數(shù)的影響Fig.2 Effects of different modeling models on kidney and spleen indexes of mice

由圖1和圖2可知，模型1組和給藥1組的胸腺指數(shù)與空白組相比，分別降低了54.27%和46.34%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）；模型2組和給藥2組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與空白組相比，脾臟指數(shù)分別增加了157.25%和113.99%，胸腺指數(shù)分別降低了24.34%和41.46%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）。給藥1組和模型1組相比，給藥組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別增加了28.78%和17.33%，說明給藥組較模型組對小鼠的免疫器官有改善作用，且趨勢靠近空白組；給藥2組和模型2組相比，給藥組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著性變化（P＞0.05），但是都有一定程度的降低，分別降低了17.17%和25.01%，并且趨勢遠離空白組。造模組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白組相比，無明顯變化（P＞0.05）。綜上結果表明，在模型1的基礎上，給藥組對小鼠的免疫器官具有一定的改善作用；在模型2的基礎上，給藥組對小鼠的免疫器官無改善作用。這說明小鼠的免疫機制破壞程度加大，給藥組已失去提高免疫力的作用。

2.5 不同建模模型對小鼠血漿中免疫球蛋白M含量的影響

免疫球蛋白M（IgM）主要分布在血液中，在機體免疫反應中出現(xiàn)最早，具有強大的抗感染作用。不同造模模型對小鼠血漿中IgM含量測定結果見圖3。

圖3 不同建模模型對小鼠血漿中免疫球蛋白的影響Fig.3 Effects of different modeling models on immunoglobulin in mice plasma

由圖3可知，造模組與空白組相比，小鼠血漿中免疫球蛋白M含量分別降低了50.37%、38.21%、162.90%、和69.25%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）。給藥1組的IgM含量與模型1組相比，增加了24.49%，說明給藥組較模型組對小鼠的免疫器官有改善作用，且趨勢靠近空白組；給藥2組的I gM含量與模型2組相比，減少了19.16%，不存在顯著性差異（P＞0.05）。綜上所述，在模型1的基礎上，給藥組對小鼠產(chǎn)IgM具有一定的調節(jié)作用；在模型2的基礎上，給藥組對小鼠產(chǎn)IgM無明顯調節(jié)作用。

2.6 不同造模模型對小鼠血漿中T細胞分型的影響

通過實驗分別對T淋巴細胞（CD3+），輔助誘導T淋巴細胞（CD3+CD4+），抑制細胞毒T淋巴細胞（CD3+CD8+）以及T輔助細胞/T抑制細胞（CD4+/CD8+）進行測定，不同造模模型對小鼠血漿中T細胞分型的影響結果分別見圖4和圖5。

圖4 不同造模模型對小鼠血漿中T細胞分型（CD3+、CD3+CD4+）的影響Fig.4 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+、CD3+CD4+)in mice plasma

圖5 不同造模模型對小鼠血漿中T細胞分型（CD3+CD8+、CD4+/CD8+）的影響Fig.5 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+CD8+、CD4+/CD8+)in mice plasma

由圖4可知，與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD3+CD4+含量分別增加了7.45%、6.44%、6.72%和8.46%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）。由圖5可知，與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD3+CD8+含量分別降低了22.08%、19.53%、30.27%和32.23%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）；與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD4+/CD8+比值分別增加了34.07%、27.88%、46.46%和54.42%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）。給藥1組的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值與模型1組相比，分別降低了0.94%，增加了3.27%，降低了4.62%，雖然都不存在顯著性差異（P＞0.05），但是給藥組數(shù)據(jù)更接近空白組；給藥2組的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值與模型2組相比，分別增加了1.63%，減少了2.81%，增加了5.44%，但是都不存在顯著性差異（P＞0.05）。

結果表明，在模型1的基礎上，給藥組對小鼠血漿中T細胞分型含量具有一定的調節(jié)作用；在模型2的基礎上，給藥組對小鼠血漿中T細胞分型含量沒有明顯的調節(jié)作用。

3 結論

通過動物實驗的體質量、免疫器官指數(shù)、血漿中免疫球蛋白M、血漿中T細胞分型等指標對小鼠建模模型進行驗證。與空白組相比，兩個模型組小鼠的體質量、免疫器官指數(shù)、免疫球蛋白M、血漿中T細胞含量都有顯著性的變化，說明本試驗的兩個建模成功。給藥1組與模型1組相比，免疫器官指數(shù)增加，IgM含量增加，CD4+/CD8+比值降低，且給藥組的數(shù)據(jù)較模型組更接近于空白組，說明給藥組對小鼠免疫具有一定的調節(jié)作用；給藥2組與模型2組相比，體質量降低，免疫器官指數(shù)降低，IgM含量降低，CD4+/CD8+比值增加，說明造模程度深，小鼠的免疫調節(jié)能力破壞大，無法恢復。但是通過給藥1組和模型1組的數(shù)據(jù)對比，可以驗證得到該配方具有調節(jié)免疫力的功能。綜上，本研究免疫功能調節(jié)驗證試驗探索出了較優(yōu)造模模型，即模型組1。并且由模型組1的建模試驗結果證明，功能性黃酒具有提高機體免疫力的功能。