欒同青 張萌萌 王文慶 郝樹彬 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

內(nèi)容提要： 根據(jù)中國藥典2015年版四部無菌檢查法，建立適用于藻酸鈣銀離子抑菌敷料的無菌試驗(yàn)方法，通過方法適用性試驗(yàn)確定：約1cm×3cm大小的檢驗(yàn)量在200mL的培養(yǎng)體系中無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，可按此方法進(jìn)行無菌檢查。

銀作為抗菌劑使用由來已久，銀離子、可溶性銀化合物、表面積大的膠態(tài)銀、納米銀等均具有殺滅革蘭氏陽性菌（G+）、革蘭氏陰性菌（G-）、真菌及部分病毒的作用[1-3]。藻酸鈣銀離子抑菌敷料可用于處理輕微擦傷、裂傷、割傷、燙傷與燒傷；也可用于壓瘡、手術(shù)后傷口、腿部潰瘍、糖尿病足部潰瘍和部分皮層燒傷等有大量滲液傷口的處理，作為防止微生物滲透的有效屏障，抑制微生物生長，有助于減輕傷口的感染。

藻酸鈣銀離子抑菌敷料與患者創(chuàng)傷組織直接接觸，按《醫(yī)療器械分類規(guī)則》規(guī)定屬第二類或第三類醫(yī)療器械，并且具有廣譜抗菌作用。按照《中國藥典》[4]規(guī)定，“進(jìn)行產(chǎn)品無菌檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查?！北狙芯恳栽逅徕}銀離子抑菌敷料為對(duì)象，擬采用擴(kuò)大培養(yǎng)基用量稀釋抗菌劑濃度的方法，建立適用于該藻酸鈣銀離子抑菌敷料的無菌試驗(yàn)方法。

1.儀器與材料

1.1 儀器

培養(yǎng)箱(Memmert IPP750plus、BINDER KB400）、厭氧工作站（ELECTROTEK AW200SG）、超凈工作臺(tái)（ESCO AVC-6D1）、電子天平（Sartorius BSA822）、生物安全柜（Thermo 1300 SERIES B2）、雙扉滅菌器（Systec DX-200-2D）、壓力蒸汽滅菌器（SANYO MLS-3780）。

1.2 材料

1.2.1 培養(yǎng)基

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)：160602）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號(hào)：160918），購自于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基即用型平板（批號(hào)：17011502）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基即用型平板（批號(hào)：16121602），購自于濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司。

1.2.2 菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]（批號(hào)：160510）、大 腸 埃 希 菌[CMCC(B)44102]（ 批 號(hào)：160705）、 生 孢梭 菌[CMCC(B)64941]（ 批 號(hào)：161223）、 白 色 念 珠 菌[CMCC(F)98001]（批號(hào)：160830），購自于北京三藥科技開發(fā)公司的定量菌珠。

1.2.3 稀釋液

0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.2.4 培養(yǎng)容器

試管、錐形瓶等。

2.試驗(yàn)方法

2.1 方法設(shè)計(jì)

按照2015年版藥典規(guī)定，根據(jù)該產(chǎn)品性狀，宜選擇直接接種法進(jìn)行該產(chǎn)品的無菌試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)，具體參數(shù)設(shè)計(jì)如下。

2.1.1 檢驗(yàn)數(shù)量

試驗(yàn)組10套；陽性對(duì)照組1套。

2.1.2 檢驗(yàn)量

剪取約1cm×3cm大小。

2.1.3 陽性對(duì)照菌株

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌。

2.1.4 陰性對(duì)照

取相應(yīng)稀釋液同法操作，作為陰性對(duì)照。

2.1.5 供試品處理及接種培養(yǎng)基

以無菌操作的方式剪取供試品約1cm×3cm大小，直接接種培養(yǎng)基。

2.1.6 培養(yǎng)基容器、用量及高度

本研究擬采用增大培養(yǎng)基用量的方式以期消除該產(chǎn)品中銀離子的抑菌作用。通過方法適用性試驗(yàn)最終確定培養(yǎng)基容器、用量及高度。擬設(shè)計(jì)系列培養(yǎng)基用量梯度為40mL（φ30mm×200mm試管，培養(yǎng)基高度9cm）、100mL（250mL錐形瓶，培養(yǎng)基高度4.5cm）、200mL（500mL錐形瓶，培養(yǎng)基高度5.5cm）。

2.2 方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 菌液制備

按照菌珠說明書進(jìn)行操作，將菌珠加至10mL0.9%無菌氯化鈉溶液，制成每1mL含菌數(shù)不大于100 cfu的菌懸液。對(duì)制備的菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)以確認(rèn)其濃度符合要求。

2.2.2 方法適用性試驗(yàn)

2.2.2.1試驗(yàn)一：40mL培養(yǎng)基

取裝有40mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管。其中1管再接入按照2.1.5處理的供試品，另1管作為對(duì)照。置于30～35°C培養(yǎng)不超過5d。

取裝有40mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6管，分別接入不大于l00cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管再接入按照2.1.5處理的供試品，另1管作為對(duì)照。置于20～25°C培養(yǎng)不超過5d。

2.2.2.2 試驗(yàn)二：100mL培養(yǎng)基

取裝有100mL培養(yǎng)基的錐形瓶按照2.2.2.1操作。

2.2.2.3 試驗(yàn)三：200mL培養(yǎng)基

取裝有200mL培養(yǎng)基的錐形瓶按照2.2.2.1操作。

3.試驗(yàn)結(jié)果

按照中華人民共和國藥典2015年版四部通則1101無菌檢查法進(jìn)行結(jié)果判斷，試驗(yàn)結(jié)果見表1～表3。

由表1、表2、表3可知，與相應(yīng)的對(duì)照管比較，40mL含供試品各容器中的試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢桿菌均生長良好，白色念珠菌和黑曲霉生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用；100mL含供試品各容器中的試驗(yàn)菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌均生長良好，黑曲霉生長微弱、緩慢或不生長，說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用；200mL含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，說明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。

表2.藻酸鈣銀離子抑菌敷料無菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(100mL)

表3.藻酸鈣銀離子抑菌敷料無菌方法適用性試驗(yàn)結(jié)果(200mL)

4.討論

本研究采用直接接種法，通過增大培養(yǎng)基量，擴(kuò)大培養(yǎng)體系，從而消除銀對(duì)微生物生長的抑制作用。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品對(duì)白色念珠菌和黑曲霉的抑制作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌和枯草芽孢桿菌，最終確定約1cm×3cm大小的檢驗(yàn)量在200mL培養(yǎng)體系下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)。無菌檢查的供試品接種方法有兩種，直接接種法和薄膜過濾法。醫(yī)療器械不同于藥品，大部分是不溶性的，若采用薄膜過濾法，則涉及到洗脫率問題，故最適宜的接種方法應(yīng)為直接接種法。采用擴(kuò)大培養(yǎng)體系的方法可解決具有抑菌作用醫(yī)療器械的無菌檢查問題。