趙富生，武庚★，張曉莉，張際緋，石學(xué)魁，劉志新，李玉婷，楊曉丹，戴安

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2. 西雙版納州人民醫(yī)院，云南 西雙版納 666100）

0 引言

施萬細(xì)胞（Schwann cells, SCs），又稱神經(jīng)膜細(xì)胞，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的一種膠質(zhì)細(xì)胞，它包繞在外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維軸突的周圍，形成髓鞘，在神經(jīng)損傷再生過程中發(fā)揮著重要作用[1]。當(dāng)損傷神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生瓦勒變性時(shí)，SCs 迅速分裂、增殖，參與吞噬變性的軸突與髓鞘碎屑。同時(shí)，形成Büngner 帶，引導(dǎo)再生軸突延伸，并分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控軸突再生和髓鞘形成過程[2,3]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone stromal stem cells, BMSCs）是骨髓內(nèi)一種非造血成體干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化潛能[4]。研究表明，在不同誘導(dǎo)條件下，BMSCs可分化為軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種組織細(xì)胞[5]。此外，BMSCs 可自體分離擴(kuò)增，有效地避免了移植引起的免疫排斥反應(yīng)，為一種理想的種子細(xì)胞[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討在不同培養(yǎng)體系中，SCs形成的微環(huán)境對(duì)BMSCs 分泌以及分化特性的影響，為應(yīng)用BMSCs 修復(fù)外周神經(jīng)損傷提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)1 月齡SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質(zhì)量90～120g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（黑）2012-010，晝夜12h 交替光照，自由食水，室溫(20±2)℃條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物、試劑和儀器

胰蛋白酶、DMEM、DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibico 公司）；CD44、CD90 兔抗大鼠單克隆抗體、S-100 兔抗大鼠多克隆抗體（Abcam 公司）；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PKH26、DAPI（Sigma 公司）；ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；Transwell（Corning公司）；體式顯微鏡（SMZ745 型，Nikon 公司）；酶標(biāo)儀（2013A70D，Thermo Fisher 公司）。

2 方法

2.1 SCs 分離培養(yǎng)及鑒定

用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，無菌條件下切斷坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)端，術(shù)后第7 天，取長(zhǎng)約2cm 預(yù)變性坐骨神經(jīng)，剝離神經(jīng)外膜，剪成1mm 小段，用0.125%的胰蛋白酶（含0.02%EDTA）和0.08%Ⅳ型膠原酶混合液（2∶1，V/V）消化30min，離心，棄上清。將神經(jīng)段植于35mm 培養(yǎng)皿，以SCs 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，第3 天半量更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)第6、12天，將神經(jīng)段移于涂有多聚賴氨酸培養(yǎng)皿中，更換含10%FBS 的SCs 培養(yǎng)液。當(dāng)SCs 鋪滿培養(yǎng)皿約80%時(shí)，傳代培養(yǎng)，行S-100 免疫熒光鑒定[7]。

2.2 BMSCs 分離培養(yǎng)及鑒定

大鼠乙醚麻醉后處死，無菌條件下分離股骨和脛骨，用10mL BMSCs 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，以120 目無菌篩網(wǎng)過濾，接種于35mm 培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)，每3 天更換培養(yǎng)液1 次，當(dāng)BMSCs 匯合至80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng)。取第2 代BMSCs，行CD44、CD90 免疫熒光鑒定[7]。

2.3 BMSCs 標(biāo)記及實(shí)驗(yàn)分組

BMSCs 標(biāo)記：取第3 代BMSCs，制備1×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基洗滌1 次，離心。用0.5mL溶液C 重懸細(xì)胞，加0.5mLPKH26 工作溶液，孵育1min，用等量的血清終止反應(yīng)，離心，棄上清，調(diào)細(xì)胞濃度至1×105/個(gè)/mL，備用。

實(shí)驗(yàn)分組：如圖1 所示，根據(jù)培養(yǎng)方式的不同 分 為3 組：A 組， 取0.5mL 第3 代SCs（1×105個(gè)/mL）與等量PKH26 標(biāo)記的第2 代BMSCs 種植于Transwell 下室接觸共培養(yǎng)；B 組，取0.5mL 第3 代SCs（1×105個(gè)/mL）種植于Transwell 上室，將等量PKH26 標(biāo)記的第2 代大鼠BMSCs 植于Transwell下室，細(xì)胞間隔PET 膜；C 組將0.5mL 第3 代SCs（1×105個(gè)/mL）植于Transwell 上室單獨(dú)培養(yǎng)，將等量PKH26 標(biāo)記的BMSCs 植于另一Transwell 下室單獨(dú)培養(yǎng)。培養(yǎng)基均為BMSCs 培養(yǎng)基。

圖1 不同培養(yǎng)體系示意圖

2.4 S-100 蛋白表達(dá)檢測(cè)

培養(yǎng)第7 天，各組隨機(jī)選取3 個(gè)Transwell 中SCs 和BMSCs，棄培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次，加細(xì)胞裂解液冰上放置30min，收集細(xì)胞裂解液，離心，取上清，BCA 法測(cè)定上清液蛋白定濃度。取適量上清液與2×loading buffer 混合，4℃沸水中煮5min，上樣（30μg/每孔），12%SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2h，滴加TBST 稀釋的山羊抗兔S-100 一抗，4℃孵育過夜，次日TBST 漂洗PVDF 膜3 次，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2h，TBST 漂洗膜3 次，DAB 顯色，凝膠成像，采用Quantity One 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3 含量檢測(cè)

細(xì)胞于接種第0、3、6、9、12、15 天上午8∶00，各組隨機(jī)收集3 個(gè)Transwell，中培養(yǎng)液上清，根據(jù)ELISA 試劑盒的操作說明，測(cè)定各組培養(yǎng)基中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3（neurotrophins-3,NT-3）的含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示。多組間比較采用單因素方差分析。兩組之間比較使用最小顯著性差異檢驗(yàn)（LSD）。P＜0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 SCs 培養(yǎng)及鑒定

SCs 培養(yǎng)第3 天，有細(xì)胞從坐骨神經(jīng)段邊緣爬出；培養(yǎng)第7 天，可見典型SCs，細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)呈極性生長(zhǎng)；培養(yǎng)第14 天，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈線狀排列，細(xì)胞端端相接連成長(zhǎng)串。傳代培養(yǎng)后，SCs 增殖旺盛，呈梭形或三角形，排列呈渦流狀（圖2A）。第3 代SCs 免疫熒光染色呈S-100 陽性，細(xì)胞兩端伸出纖長(zhǎng)突起，相互重疊呈網(wǎng)狀（圖2B）。

圖2 SCs 原代培養(yǎng)及鑒定(×100)

3.2 BMSCs 培養(yǎng)及鑒定

接種第1 天，BMSCs 呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)3～5 天后，BMSCs 呈不規(guī)則形、多角形或有小突起，貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)5～12 天，BMSCs 增殖明顯增快，細(xì)胞呈束狀或旋渦樣排列（圖3A）。當(dāng)BMSC 鋪滿培養(yǎng)培養(yǎng)皿約80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后BMSC 體積較原代細(xì)胞大，形態(tài)趨于同一。如圖3B 和C 所示，免疫熒光染色鑒定BMSC 呈CD44、CD90 表達(dá)陽性。

圖3 BMSC 原代培養(yǎng)及鑒定(×100)

3.3 S-100 蛋白表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)第7 天，取各組細(xì)胞檢測(cè)S-100 蛋白表達(dá)水平。如圖4 所示，與C 組相比較，A、B 組S-100 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與B 組相比較，A 組S-100 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果提示，SCs 與BMSCs 直接和間接共培養(yǎng)均可促進(jìn)BMSCs 向SCs 向膠質(zhì)樣細(xì)胞分化，以直接培養(yǎng)體系效果更為顯著。

圖4 不同培養(yǎng)體系中S-100 蛋白表達(dá)水平比較

3.4 NT-3 含量比較

在細(xì)胞培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)，取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)NT-3。如圖5 所示，在細(xì)胞培養(yǎng)第0 天，A、B 和C 組中NT-3 含量無顯著性差異（P＞0.05）；從培養(yǎng)第3 天開始，A 組和B 組中NT-3 含量均呈現(xiàn)時(shí)間依賴性增加，以培養(yǎng)第9 天最為顯著。與C 組相比較，A 組和B 組中NT-3 含量均明顯增高（P＜0.05）；與B 組相比較，A 組培養(yǎng)液上清中NT-3 含量顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果提示，在直接共育體系中SCS能夠有效促進(jìn)BMSCs 合成NT-3。

圖5 不同培養(yǎng)體系中NT-3 含量比較

4 討論

在臨床中，外周神經(jīng)組織損傷大約占創(chuàng)傷患者的2.8%[8]，往往導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)功能障礙，甚至造成永久性殘疾，給社會(huì)和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，采用以干細(xì)胞為種子細(xì)胞的組織工程方法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷成為神經(jīng)科學(xué)研究熱點(diǎn)[9,10]。

近年來，許多學(xué)者致力于BMSCs 分化的研究。研究表明，在不同誘導(dǎo)條件下，BMSCs 具有不同的分化能力和分化方向，可被定向誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞[11,12]。體外BMSCs 可定向誘導(dǎo)分化為SCs 樣外周膠質(zhì)細(xì)胞，并能夠分泌腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor, NGF）和NT-3 等多種營(yíng)養(yǎng)因子。研究報(bào)道，將人BMSCs 進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化為類SCs，并以基質(zhì)膠為載體將SCs 以2×107個(gè)/mL 細(xì)胞濃度移植到可滲透性導(dǎo)管中，修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，能有效促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)軸突再生和髓鞘形成[13]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，引起神經(jīng)元凋亡以及軸突脫髓鞘等病理變化，導(dǎo)致不可逆性功能障礙。因此，研究者試圖通過移植干細(xì)胞來替代壞死凋亡神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。在臨床中，自體神經(jīng)干細(xì)胞來源有限，異體移植存在免疫排斥反應(yīng)，限制了其在臨床中的應(yīng)用。BMSCs 易于獲取、可自體移植，有效的避免了組織移植排斥反應(yīng)發(fā)生[14]。研究顯示，以白藜蘆醇、刺五加或以堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子均可誘導(dǎo)BMSCs 分化為神經(jīng)元[15-17]。為探討B(tài)MSCs 在SCs 形成的不同微環(huán)境中的分化及分泌功能是否存在差異，本研究以不同的培養(yǎng)體系取代了傳統(tǒng)的化學(xué)誘導(dǎo)方法。將BMSCs 與SCs 直接接觸培養(yǎng)或培養(yǎng)于同一雙層培養(yǎng)皿中，中間以微孔網(wǎng)膜相隔，細(xì)胞不能從微孔中通過，而SCs 分泌的一些成分則可以通過網(wǎng)孔作用BMSCs，來模擬體內(nèi)不同的神經(jīng)微環(huán)境。我們研究結(jié)果顯示，SCs 與BMSCs 直接接觸培養(yǎng)可有效誘導(dǎo)BMSCs 向外周膠質(zhì)細(xì)胞分化。

為驗(yàn)證分化后BMSCs 的分泌功能，我們選擇了NT3 作為研究對(duì)象。結(jié)果顯示，SCs 與BMSCs 接觸共培養(yǎng)組上清液中NT-3 含量明顯高于其它兩組。NT-3是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的信號(hào)蛋白，具有刺激神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖、分化、促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[18]。研究顯示，NT-3 的受體存在于細(xì)胞膜上，NT-3 與其相應(yīng)受體結(jié)合，可將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化過程[19]。研究者認(rèn)為，BMSCs 之所以能在不同的微環(huán)境中分化為不同的組織細(xì)胞，如在肝臟能夠分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞[20]，在缺氧狀態(tài)下可轉(zhuǎn)化為神經(jīng)前體細(xì)胞[21]，在神經(jīng)系統(tǒng)不同部位可分化為不同類型的神經(jīng)樣細(xì)胞，可能是由于BMSCs 的分化依賴于其所處微環(huán)境中的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，這些細(xì)胞與BMSCs 形成的緊密接觸有助于BMSCs 的錨靠并促進(jìn)其形態(tài)和基因表達(dá)模式的改變。

總之，在接觸共培養(yǎng)體系中SCs 可有效誘導(dǎo)BMSCs 向外周膠質(zhì)細(xì)胞分化，并促進(jìn)BMSCs 的分泌功能，但有關(guān) BMSCs 分化的確切機(jī)制尚不清楚 , 有待進(jìn)一步深入研究。