蒙丹麗,梁列新,陳建紅,宋懷宇

蒙丹麗,梁列新,宋懷宇,廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

陳建紅,廣西測(cè)試中心 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

核心提要： 本文以乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭(acute-onchronic liver failure,ACLF)患者為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)ACLF患者腸道丙酸、異戊酸、總短鏈脂肪酸譜(short chain fatty acids,SCFAs)水平下降,而發(fā)生肝性腦病患者的腸道乙酸、丙酸、總SCFAs水平較未發(fā)生者下降,SCFAs下降可能在慢加急性肝衰竭中起到一定作用,值得探索.

0 引言

慢加急性肝衰竭患者病情重,病情變化快,死亡率高達(dá)50%-90%[1],雖然經(jīng)過(guò)多年攻關(guān)研究,但仍然療效不夠理想,值得深入研究.我們的前期研究發(fā)現(xiàn),慢性重度乙型肝炎患者腸黏膜通透性較正常人明顯增高,腸道屏障功能受損[2].而慢性重度乙型病毒性肝炎進(jìn)展到慢性加急性肝衰竭的病人并不少見(jiàn).腸道短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)可減少腸道通透性,增強(qiáng)腸黏膜屏障,同時(shí)還參與肝臟能量供應(yīng)[3,4].但目前少見(jiàn)慢加急性肝衰竭與腸道SCFAs水平的相關(guān)研究.本研究應(yīng)用高效液相色譜法(High efficiency liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者糞便SCFAs水平變化,旨在研究其變化與正常人有無(wú)不同,并探討腸道SCFAs水平與肝性腦病、肝功能儲(chǔ)備的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2013-01/2015-12在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科、南寧市第四人民醫(yī)院肝病科確診的乙肝相關(guān)ACLF住院患者作為病例組,同期體檢健康者作為對(duì)照組.研究取得廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)同意.

納入的病例組患者滿足2012年修訂的《肝衰竭診治指南》[5]中慢加急性肝衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn).合并肝性腦病者的診斷符合《中國(guó)肝性腦病診治共識(shí)意見(jiàn)(2013)》[6]中肝性腦病的診斷標(biāo)準(zhǔn).病例組共25例,其中男21例,女4例,年齡范圍21-65歲,平均年齡42歲±12歲.

病例組的排除標(biāo)準(zhǔn)為：同時(shí)患有其他型病毒性肝炎、肝癌、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病或者自身免疫性肝病者;合并高血壓病、糖尿病、胃腸道腫瘤、慢性胃腸道疾病(克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、腸易激綜合征等);有消化道手術(shù)史,近1 mo內(nèi)有急性胃腸道疾病癥狀者;孕婦、哺乳期女性,或患有精神疾病者;取標(biāo)本前4 wk內(nèi)使用抗生素、微生態(tài)制劑;取標(biāo)本3 d前使用抗性淀粉、歐車前/卵葉車前、燕麥麩、菊粉、乳果糖等.

對(duì)照組為體檢健康者,既往無(wú)肝炎病史、無(wú)肝病癥狀、體征,肝功能無(wú)異常,肝炎病毒標(biāo)記物陰性.共15名,其中男5例,女10例,年齡范圍24-57歲,平均39歲±10歲.

1.2 方法

1.2.1 資料收集：收集病例組及對(duì)照組的一般人口學(xué)資料、病史資料、實(shí)驗(yàn)室檢查等.予改良的Child-Pugh分級(jí)對(duì)肝功能儲(chǔ)備進(jìn)行評(píng)估.

1.2.2 血標(biāo)本的采集、檢測(cè)：清晨時(shí)抽取空腹靜脈血,統(tǒng)一檢測(cè)血常規(guī)、肝腎功能、病毒性肝炎(甲、乙、丙、丁、戊型)抗原抗體檢測(cè)、HBV-DNA、甲胎蛋白等.

1.2.3 糞便標(biāo)本的采集、保存、預(yù)處理及測(cè)定：(1)采集、保存、預(yù)處理：取當(dāng)日新鮮糞便10 g,置于清潔糞便盒,-80 ℃冰箱中冷凍保存,待成批檢測(cè).取0.5 g糞便樣本自然解凍,取其中0.3 g糞便標(biāo)本裝到塑料管,加入1000 ul超純水,渦旋振蕩,離心(4 ℃,1900 g,10 min),初步去除粗顆粒,取上清液,再次離心(4 ℃,10000 g ,10 min)后,取上清液經(jīng)Millex-GS 0.22 μm濾膜過(guò)濾,留取濾過(guò)液送檢.(3)測(cè)定：用HPLC法,采用美國(guó)Waters 2695高效液相色譜儀,檢測(cè)器為2996-紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為217 nm.乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸等SCFAs的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司.色譜條件：色譜柱：YMC-Pack ODS-AQ色譜柱(250 mm×4.6 mm),磷酸二氫銨(pH 2.7)：甲醇 = 7：3,流速：0.8 mL/min,進(jìn)樣量50 μL,柱溫：30 ℃.以上5種SCFAs及總SCFAs水平通過(guò)色譜圖峰面積計(jì)算.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理滿足正態(tài)分布數(shù)據(jù)予t檢驗(yàn),不滿足正態(tài)性數(shù)據(jù),則采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn).數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(QR)]或mean±SD表示,采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 病例組基本資料 病例組與對(duì)照組的年齡差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),病例組及對(duì)照組基本資料如表1所示.

2.2 腸道SCFAs色譜圖采用HPLC法,測(cè)出病例組及對(duì)照組糞便中5種SCFAs水平圖譜,如圖1所示,從色譜圖可以看出,兩組標(biāo)本的譜峰分離良好,滿足測(cè)定要求.

2.3 兩組腸道SCFAs水平比較 病例組、對(duì)照組的各SCFAs及總SCFAs水平如表2所示,其中丙酸、異戊酸、總SCFAs水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).

2.4 ACLF患者伴/不伴肝性腦病組腸道SCFAs水平比較

病例組中按是否合并肝性腦病分為肝性腦病組(n= 6)、無(wú)肝性腦病組(n= 19)兩組,對(duì)比腸道SCFAs水平差異.如表3所示,發(fā)現(xiàn)合并肝性腦病的慢重肝患者腸道乙酸、丙酸、總SCFAs水平較無(wú)肝性腦病患者低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).

2.5 ACLF患者不同Child-Pugh分級(jí)、HBV-DNA水平的腸道SCFAs水平比較 將病例組患者按肝功能儲(chǔ)備不同可分為2組：Child-Pugh B級(jí)(n= 9)、Child-Pugh C級(jí)(n= 16),本研究中無(wú)Child-Pugh評(píng)分為A級(jí)的病人.如表4所示,Child-Pugh B級(jí)糞便乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、總SCFAs水平均低于Child-Pugh B級(jí)的患者.其中,Child-Pugh C級(jí)組的乙酸水平降低有統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05).如表5所示,病例組中,HBV陽(yáng)性與陰性的患者各SCFAs及總SCFAs水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.05).

為了滿足阻尼力可變要求，阻尼力可變減振器在常規(guī)液壓減振器基礎(chǔ)上增加了調(diào)整阻尼力的附加功能，主要附加功能除了空氣彈簧功能系統(tǒng)之外，近年來(lái)還有使用氣動(dòng)減振控制(PCD減振器)；比例電磁閥(或步進(jìn)電機(jī))調(diào)整阻尼力減振器以及磁流變液體減振器，

3 討論

SCFAs是包含1-6個(gè)碳原子的有機(jī)酸,包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸、乳酸等.腸道SCFAs對(duì)腸道的能量供應(yīng)、腸黏膜屏障的維持、腸道免疫調(diào)節(jié)等方面有重要作用[3].SCFAs可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)腸上皮細(xì)胞、加粘液層分泌、增加緊密連接蛋白合成等增強(qiáng)腸道屏障、減少腸道通透性[7-9],此外腸道SCFAs還參與肝臟能量供應(yīng)[4].我們的前期研究發(fā)現(xiàn),慢性重度乙型肝炎患者腸黏膜通透性較正常人明顯增高,存在早期腸道屏障損害,并對(duì)其病情發(fā)展有促進(jìn)作用[2].

本研究發(fā)現(xiàn),ACLF患者的腸道丙酸、異戊酸、總SCFAs水平明顯低于正常人.有報(bào)道富膳食纖維飲食、腸道產(chǎn)SCFAs菌多、腸道轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)等均可使腸道SCFAs產(chǎn)生增多[10].慢加急性肝衰竭患者消化道癥狀明顯,食欲明顯減退,從而導(dǎo)致SCFAs飲食來(lái)源減少.Li等[11]發(fā)現(xiàn),慢性重型肝炎患者腸道擬桿菌、雙歧桿菌等主要產(chǎn)SCFAs細(xì)菌數(shù)量明顯減少,而腸桿菌數(shù)量增加.擬桿菌則主要產(chǎn)丙酸、乙酸,雙歧桿菌主要產(chǎn)乙酸、乳酸.產(chǎn)SCFAs菌群減少可能使腸道丙酸、異戊酸、總SCFAs等水平下降.因此,ACLF患者腸道SCFAs水平下降,可能是食物攝入不足和腸道菌群變化共同作用的結(jié)果.腸道SCFA的減少,反過(guò)來(lái)加重腸道上皮細(xì)胞損害,使得腸道通透性增加、內(nèi)毒素移位增加,促進(jìn)疾病進(jìn)展.

表1 基本資料

表2 病例組、對(duì)照組短鏈脂肪酸的水平[M(QR),mmol/L]

表3 病例組肝性腦病及無(wú)肝性腦病組患者的短鏈脂肪酸水平對(duì)比[M(QR)/mean±SD,mmol/L]

表4 病例組不同Child-Pugh分級(jí)的乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者短鏈脂肪酸水平[M(QR)/mean±SD,mmol/L]

當(dāng)肝功能嚴(yán)重受損或者存在門體分流等時(shí),氨、SCFAs、硫醇、酚類等產(chǎn)物進(jìn)入腦組織增多,協(xié)同參與肝性腦病的發(fā)生.SCFAs進(jìn)入大腦后可能通過(guò)影響神經(jīng)傳導(dǎo)、干擾腦組織能量代謝,導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)意識(shí)障礙癥狀[12].在王慧[13]的研究中,30名肝性腦病患者腸道

產(chǎn)SCFAs菌擬桿菌、雙歧桿菌較正常對(duì)照組明顯減少.我們研究發(fā)現(xiàn)伴肝性腦病的ACLF患者,腸道乙酸、丙酸、總SCFAs等水平下降,其原因我們推測(cè)一方面可能有腸道SCFAs總合成水平降低的原因,另一方面不排除是腸道通透性增加,由腸道進(jìn)入外周血中的SCFAs相對(duì)增多,進(jìn)而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的SCFAs水平增高,參與ACLF患者肝性腦病的發(fā)生.

表5 病例組不同HBV-DNA水平的乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者短鏈脂肪酸水平[M(QR)/mean±SD,mmol/L]

圖1 病例組、對(duì)照組短鏈脂肪酸測(cè)定液相色譜圖.A：乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭患者糞便短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)高效液相色譜圖;B：健康體檢者糞便SCFAs高效液相色譜圖.

有研究發(fā)現(xiàn),慢性乙型病毒性肝炎后肝硬化患者腸道主要產(chǎn)SCFAs菌——擬桿菌豐度與Child-Pugh評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[14].肝硬化患者腸道產(chǎn)乙酸菌雙歧桿菌減少,Child-Pugh B、C級(jí)患者菌群失調(diào)較A級(jí)嚴(yán)重[15].本研究中,Child-Pugh C級(jí)的患者乙酸水平顯著低于Child-Pugh B級(jí)患者,與上述研究有吻合之處,但其他腸道SCFA水平未提示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能和本研究樣本量偏小有關(guān),仍待今后進(jìn)一步研究.本文中研究對(duì)象為ACLF,并未發(fā)現(xiàn)不同HBV-DNA水平的患者腸道SCFAs水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,兩者關(guān)系有待研究.

總之,我們發(fā)現(xiàn)ACLF患者腸道SCFAs水平明顯低于正常人,伴肝性腦病的患者腸道乙酸、丙酸、總SCFAs水平較無(wú)肝性腦病患者下降,Child-Pugh評(píng)分為C級(jí)的患者乙酸水平較Child-Pugh B級(jí)患者低,以上發(fā)現(xiàn)提示腸道SCFAs的變化可能在ACLF患者的病情進(jìn)展中發(fā)揮一定的作用,針對(duì)腸道SCFAs的干預(yù)措施有可能是改善其預(yù)后是一個(gè)新的研究方向,值得臨床進(jìn)一步深入研究.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

乙肝相關(guān)慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)病情進(jìn)展快,預(yù)后差.慢性重型乙肝患者腸道黏膜通透性增高短鏈脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)在營(yíng)養(yǎng)腸道、維持腸道屏障、肝臟能量代謝中發(fā)揮作用,其變化可能在該病中起到一定保護(hù)作用.

無(wú)論是在采用快速維修的模式和方法上，還是認(rèn)識(shí)到保險(xiǎn)公司傾向于與維修連鎖集團(tuán)合作的現(xiàn)實(shí)方面，AMA與CapitalSmart兩家集團(tuán)都對(duì)澳大利亞事故車維修市場(chǎng)產(chǎn)生了重大影響。受其影響，市場(chǎng)上僅有2～6個(gè)小型門店的維修連鎖集團(tuán)數(shù)量在逐漸增加。但據(jù)說(shuō)，AMA集團(tuán)在過(guò)去6個(gè)月里已經(jīng)收購(gòu)了兩家這樣的小型維修連鎖集團(tuán)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

通過(guò)比較ACLF與正常對(duì)照、不同病情(肝性腦病,Child-Pugh分級(jí)等)患者糞便SCFAs變化情況,初步探究腸道SCFAs與該病的關(guān)聯(lián).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究結(jié)果為探索SCFAs在ACLF患者疾病治療、病情預(yù)后評(píng)估方面提供了線索,為未來(lái)的深入研究提供了方法參考.

實(shí)驗(yàn)方法

通過(guò)高效液相色譜技術(shù),檢測(cè)到患者的腸道SCFAs水平下降,并且在合并癥較多、病情較重時(shí)某些SCFAs含量下降,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,為SCFAs在該病的進(jìn)一步應(yīng)用提供線索,達(dá)到了研究目的.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)ACLF患者腸道丙酸、異戊酸、總SCFAs水平下降,而發(fā)生肝性腦病患者較未發(fā)生肝性腦病患者的腸道乙酸、丙酸、總SCFAs水平下降,病情較重的Child-Pugh C級(jí)的患者乙酸水平低于Child-Pugh B級(jí)患者,提示SCFAs可能在這一疾病的發(fā)生發(fā)展中有一定作用,某些SCFAs可能與特定疾病進(jìn)展有關(guān),未來(lái)值得進(jìn)一步研究.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

ACLF患者腸道SCFAs水平下降;腸道乙酸、丙酸、總SCFAs水平下降,可能參與肝性腦病的發(fā)病;腸道乙酸水平可在一定程度上反映肝臟的儲(chǔ)備功能.本研究采用高效液相法檢測(cè)SCFAs,提示結(jié)果較穩(wěn)定,適合推廣.

展望前景

因本研究為初步探索性研究,研究病例數(shù)相對(duì)偏少,且未能納入肝硬化等患者人群,未來(lái)有待擴(kuò)大樣本量、擴(kuò)大患者人群,也有待從分子水平等進(jìn)一步探究,以期對(duì)臨床有更大的指導(dǎo)意義.