劉偉怡，劉鳳銀，江海超，王宇，劉佳，鄒紅麗，穆洪濤*

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院廣東廣州 5103032; 2.廣州市食品檢驗所廣東廣州 511400）

青霉素類抗生素藥物屬于窄譜殺菌性抗生素，可通過抑制革蘭氏陽性菌胞壁的形成，使細菌胞壁破損、胞內(nèi)滲透壓下降，菌體漲裂而死亡，從而起到殺菌作用，具有高效、低毒的特點[1]。非治療目的用藥、執(zhí)行休藥期規(guī)定不嚴格、非法人為摻雜、飼養(yǎng)管理不當、抗生素濫用等都會導致青霉素類抗生素在畜產(chǎn)品中殘留[2]。青霉素類抗生素殘留不僅可能會導致產(chǎn)生耐藥菌株[3]，免疫抑制、體內(nèi)蓄積、破壞人體微生態(tài)平衡、破壞環(huán)境，而且可能會引發(fā)過敏反應，其引起的過敏性休克，可嚴重影響人體健康安全[4]。

目前，國內(nèi)外文獻報道的青霉素類抗生素殘留檢測方法主要有微生物檢測法（MIT)[5]、高效液相色譜法（HPLC）[6]、熒光免疫測定法[7]、青霉素生物傳感器檢測[8]、光譜法[9]等。微生物測定法前處理簡單、成本低，但其易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；免疫分析法簡便快速、靈敏度高和特異性強，但程序復雜且易受到其他因素影響；理化分析法具有高靈敏度和高精確度，但對操作人員和儀器要求較高。

青霉素酶聯(lián)免疫檢測方法一般采用多克隆抗體的方法，其特異性不夠強，篩選工作量大，即使運用了標記的方法，也會造成不易區(qū)分、工作繁重等問題。并且免疫法現(xiàn)存的問題（廣譜性不夠高），其試劑盒只能單獨檢測某一種抗生素殘留，在實際應用是多種抗生素聯(lián)用，需要用上多種試劑盒[10]。本研究通過制備獲得廣譜性識別青霉素類抗生素的抗體，建立針對牛奶中青霉素類抗生素殘留的廣譜性酶聯(lián)免疫分析方法。通過此種方法可以一次性篩查全部青霉素類抗生素，從而為青霉素類抗生素的監(jiān)控和管理提供有力的檢測方法。

1 材料

1.1 實驗動物

重2 kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與材料

青霉素類抗生素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、N-羥基琥珀酰亞胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、其他化學試劑均為分析純；均購于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。實驗用水為超純水。酶標板購于廈門怡佳美實驗器材有限公司。

1.3 主要儀器

SP-Max2300A光吸收型全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）、全自動洗板機（深圳雷社生命科學股份有限公司）、電子天平（上海越平科學儀器有限公司生產(chǎn)）、UV755B紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 人工抗原的制備及鑒定

采用活潑酯法將青霉素G制備人工抗原PENBSA、PEN-OVA，并通過紫外光譜確證偶聯(lián)是否成功。

2.2 PEN多克隆抗體的制備

將免疫原PEN-OVA對新西蘭大白兔進行免疫，采用背部皮下多點注射，第六次免疫4～6天后心臟采血收集全部血清，分離血清后加上具有防腐作用的0.02%NaN3，用間接ELISA方法測定血清效價。

2.3 間接ELISA方法的建立

用已確定的抗原包被濃度稀釋抗原，1 μg/mL包被酶標板，100 μL/孔，37 ℃孵育過夜，洗板兩次，加入封閉液120 μL/孔，37 ℃孵育3小時，甩干，37 ℃烘干1h；每孔加陽性血清100 μL，37 ℃孵育40 min，洗板5次；加入HRP標記的羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次；加入顯色液100 μL/孔，37 ℃孵育10 min，最后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，測定A450。

3 結(jié)果與討論

3.1 偶聯(lián)產(chǎn)物鑒定

紫外分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度，結(jié)果見圖1，兩種分子PEN-BSA、PEN-OVA均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)，初步鑒定人工抗原偶聯(lián)成功。

3.2 新西蘭大白兔血清效價的測定

抗體效價是評價抗體性能的一個重要指標，通過間接ELISA法測定兩只兔抗血清效價都高達10-5，說明抗體在很低的濃度范圍內(nèi)，仍能與抗原反應，二者之間有很強的結(jié)合力。此外，免疫分析中使用高效價的抗體可提高檢測的靈敏度。

3.3 同源與異源ELISA方法的選擇

首先活潑酯法分別將半抗原（氯唑西林鈉（CLO）、苯唑西林鈉（OXA）、羧芐西林鈉（CAR）、磺芐西林鈉（SUL）、青霉素V（PENV）、氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AMO）、6-氨基青霉烷酸（6-APA）與OVA偶聯(lián)成8種包被原，經(jīng)紫外掃描鑒定包被原偶聯(lián)成功。采用間接ELISA法，進行青霉素類抗生素異源包被選擇，以提高靈敏度。由圖2結(jié)果可知，以CAR-OVA為異源包被原檢測最高效價為9000，PENV-OVA作為包被原時效價為4000；且CAROVA的抑制率高于其他異源包被原，因此，選擇羧芐青霉素鈉與OVA偶聯(lián)而成的人工抗原（CAR-OVA）作為異源包被原。

圖1 PEN-BSA、PEN-OVA偶聯(lián)物組合圖

圖2 同源與異源血清效價檢測曲線

3.4 包被抗原和抗體最佳工作濃度試驗結(jié)果

選取同源PEN-OVA，異源CAR-OVA作為包被原，采用間接ELISA方法、方陣滴定法確定抗原和抗體最佳的工作濃度。根據(jù)表1結(jié)果，當選擇CAROVA作為包被原時方法的靈敏度最高，其IC50最小，因此選用異源包被原CAR-OVA的最佳工作濃度1 μg/mL，2號兔抗血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶8000。

3.5 ELISA方法的優(yōu)化

采取控制單因素條件的方法，逐步優(yōu)化各個條件，按照間接競爭ELISA法的程序，以CAR-OVA最佳工作濃度包被，對比不同條件下的Amax和IC50，綜合考慮IC50/Amax值較小且曲線擬合度較好。由表2結(jié)果可知，實驗選擇37 ℃過夜包被、封板30 min、競爭反應和二抗反應40 min、顯色反應10 min，其IC50、IC50/Amax值最小。

表1 在不同包被原和抗體最佳濃度下的IC50

表2 ELISA方法的優(yōu)化

3.6 特異性的測定

結(jié)構(gòu)類似的青霉素類藥物引起的交叉反應大小可以用來表示抗體的特異性，也可以描述分析方法的特異性。間接ELISA法測定交叉反應結(jié)果見表3。以PEN多克隆抗體與PEN特異反應率為100%，抗體與青霉素V特異反應率為0.1%，其他8種青霉素類藥物與之交叉反應率很低，結(jié)果表明本研究制備的PEN多克隆抗體是高特異性的。

這主要是由于多克隆抗體識別青霉素G的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，青霉素G和青霉素V側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似，青霉素G的側(cè)鏈基團為苯乙酰氨基，青霉素V的側(cè)鏈基團為苯氧乙酰氨基，而其他青霉素類抗生素的結(jié)構(gòu)與青霉素G存在較大的差異，抗體不能識別，因此交叉反應率低。

表3 PEN多克隆抗體與其他青霉素類藥物的交叉反應

3.7 標準曲線的建立

所有優(yōu)化條件確定后，將青霉素G標準品配成濃度為0 ，0.064，0.32，8，40，200，1000 μg/mL系列濃度，用ELISA法建立標準曲線見圖3，計算曲線的線性回歸方程為y=-0.2025x+0.7625，相關(guān)系數(shù)0.9691，其中線性范圍介于0.064～200μg/mL，抑制率為50 %時，最低可檢測濃度為2.22 μg/mL，檢測限為0.14 μg/mL。

圖3 青霉素G的間接ELISA標準曲線

3.8 準確性的測定（添加回收率）

在早餐奶、舒化奶、高鈣奶和純牛奶中添加PEN標準溶液（1、10、100 μg/mL），每份樣品的提取液做3個平行重復。其回收率和變異系數(shù)測定結(jié)果如表4。四種牛奶中，樣品回收率范圍在74.0%～106.3%，變異系數(shù)小于0.21%，達到獸藥殘留分析要求。

表4 PEN回收率的測定（n=3）

4 結(jié)論

本文利用青霉素G所獲得的PEN多克隆抗體，效價高于1：105，與其他8種青霉素類藥物交叉反應很低。通過優(yōu)化一系列條件，CAR-OVA為最佳的異源包被原以提高靈敏度，建立了PEN標準曲線，最低可檢測濃度為2.22 μg/mL，檢測限為0.14 μg/mL。添加回收率的范圍為74.0%～106.3%，變異系數(shù)小于0.21%。綜上所述，獲得的青霉素G多克隆抗體特異性強、親和力高，為青霉素G多組分殘留快速免疫分析奠定理論基礎(chǔ)。