唐 媛，時羽杰，龍曉明，余海萍，鄔曉勇

(1.成都大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106；2.成都大學 藥學與生物工程學院，四川 成都 610106)

0 引 言

雙水相，即聚合物的不相容性.目前，雙水相萃取技術因具有條件溫和、容易放大及可連續(xù)操作等特點，已在生物物質的分離純化中得到廣泛應用[1-2].研究表明，影響雙水相分配系數(shù)的因素有很多，包括成相聚合物的相對分子質量、聚合物的濃度、鹽的種類與鹽的濃度等[3].對此，科研人員對其進行了大量研究，并取得了一系列成果[4-6]，但對不同雙水相體系的萃取能力的研究比較少.因此，本實驗構建了兩種無機鹽與PEG4000的雙水相體系，通過對牛血清白蛋白的萃取過程的分析得到所建立萃取體系的最佳質量分數(shù)，并分析了其最佳萃取條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實驗所用材料包括：PEG4000(批號，20160422)、NaH2PO4(批號，20150511)、(NH4)2SO4(批號，2018010501)、考馬斯亮藍G-250(批號，20170522)、0.1 mg/mL牛血清白蛋白(批號，20161206)，均購自成都市科隆化學品有限公司.

1.1.2 儀 器.

實驗所用儀器包括：CPA22-D型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，UV-2600A型紫外—可見分光光度計(龍尼柯(上海)儀器有限公司)、IKA VORTEX GENIUS 3型漩渦振蕩器(艾卡(廣州)儀器設備有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 牛血清白蛋白標準曲線.

利用文獻[7]中的方法制備標準曲線.取6支刻度試管分別加入0.1 mg/mL牛血清白蛋白0.00 、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0 mL，然后分別加入5.00 mL考馬斯亮藍G-250，立即于595 nm波長處測定吸光度.以標準蛋白濃度為橫坐標，相應的吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線.

1.2.2 PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖.

參考文獻[8]中的相關方法制備相圖，采用濁點法進行，稍加改動.先配制質量分數(shù)為30%的NaH2PO4溶液和(NH4)2SO4溶液并分別測定其密度.精密稱取0.2 g PEG4000于大試管中，按文獻[8]中的方法依次操作，制作出2條雙曲線的相圖.為便于計算，每次加水量固定為0.3 mL.之后，以PEG4000的質量分數(shù)為縱坐標，分別以NaH2PO4和(NH4)2SO4的質量分數(shù)為橫坐標作圖，制得到2條相圖.

1.2.3 確定PEG4000/ NaH2PO4與PEG4000/(NH4)2SO4最佳體系.

1)確定PEG4000質量分數(shù).根據(jù)上述相圖，準備14支刻度試管，7支為一組，共2組.一組加入一定量的NaH2PO4，另一組加入(NH4)2SO4，之后分別加入PEG4000，雙蒸水定容至10 mL.然后每組分別加入1 mL牛血清白蛋白，搖勻，并靜置至分層，分別取各刻度試管上相、下相溶液測蛋白含量.計算出各組的分配系數(shù)K，取最小值作為最適PEG4000的質量分數(shù).

2)確定NaH2PO4和(NH4)2SO4的質量分數(shù).同上操作，每支試管按照上述確定的PEG4000質量分數(shù)，分兩組分別梯度加入NaH2PO4和(NH4)2SO4，之后定容至10 mL.每組分別加入1 mL牛血清白蛋白，搖勻，并靜置至分層.分別取各刻度試管上相、下相溶液測蛋白含量.計算出各組的分配系數(shù)K，取最小值作為最適的兩種無機鹽的質量分數(shù).

1.2.4 蛋白起始濃度對兩種雙水相系統(tǒng)萃取的影響.

設置蛋白濃度最大為3 mg/mL，然后經(jīng)過稀釋，獲得6個濃度分別為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL的系列蛋白溶液.根據(jù)上述確定的最佳的PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4組合，分別構建6個雙水相體系并編號，各刻度試管依序加入各濃度蛋白溶液1 mL，搖勻，并靜置至分層，分別取各刻度試管上相、下相溶液測定蛋白含量.同時觀察記錄上下相體積等，通過計算得到各組的分配系數(shù)K和回收率Y上、Y下.

1.2.5 雙水相體系蛋白質的相關計算公式.

1)分配系數(shù).

K=C1/C2

2)相比.

R=V1/V2

3)回收率.

Y上=C1V1/(C1V1+C2V2)；

Y下=C2V2/(C1V1+C2V2)

式中，C1、C2分別為上相、下相中蛋白的總濃度，mol/L；V1、V2分別為上相、下相的體積，mL；Y上、Y下分別為上相、下相的回收率，%.

2 結果與分析

2.1 牛血清白蛋白標準曲線

根據(jù)“1.2.1”項下方法所得到的牛血清白蛋白的標準曲線為，Y=0.341 8X-0.013 1，R2=0.995 2.結果表明，蛋白濃度與吸光度間線性關系良好，可以用于后續(xù)蛋白含量的測定.

2.2 雙水相體系的相圖

根據(jù)“1.2.2”項下方法得到PEG4000/NaH2PO4和PEG4000/(NH4)2SO4兩種雙水相體系的相圖如圖1所示.

圖1兩種雙水相體系相圖

從圖1可以看出，同樣條件下PEG4000/NaH2PO4體系的成相所需濃度要比PEG4000/(NH4)2SO4體系的成相濃度更低.

2.3 最佳萃取體系的確定

2.3.1 確定PEG4000/NaH2PO4的最佳萃取體系.

按照“1.2.3”項下“1)”中的方法，待每支試管萃取平衡后，先讀取上、下相的體積，之后分別取上、下相溶液檢測蛋白含量，按照公式計算分配系數(shù)K，結果見表1.

表1 PEG4000/NaH2PO4最佳萃取體系的確定

由表1可知，分配系數(shù)K值最小時PEG4000/NaH2PO4體系的最佳PEG4000質量分數(shù)11.50%，此時分配系數(shù)K值最小為0.44；而最佳NaH2PO4的質量分數(shù)20%，此時分配系數(shù)K值最小為0.45.因此，PEG4000/NaH2PO4最佳萃取體系為11.5% PEG4000/20% NaH2PO4.

2.3.2 確定PEG4000/(NH4)2SO4的最佳萃取體系.

同上，待每支試管萃取平衡后，先讀取上、下相的體積，之后分別取上、下相溶液檢測蛋白含量，按照公式計算分配系數(shù)K，結果見表2.

表2 PEG4000/(NH4)2SO4最佳萃取體系的確定

由表2可知，分配系數(shù)K值最小時PEG4000/(NH4)2SO4體系的最佳PEG4000質量分數(shù)為12%，此時分配系數(shù)K值最小為0.54；而最佳(NH4)2SO4的質量分數(shù)17.5%，此時分配系數(shù)K值最小為0.42.因此，PEG4000/(NH4)2SO4最佳萃取體系為12%PEG4000/17.5%(NH4)2SO4.

2.4 不同濃度牛血清白蛋白在雙水相體系中的萃取

2.4.1 PEG4000/NaH2PO4體系中牛血清白蛋白的萃取行為.

按照“1.2.4”項下的方法，將梯度濃度的蛋白溶液加入到優(yōu)化后的11.5% PEG4000/20% NaH2PO4體系中，待萃取平衡后，進行測定，結果見表3.

表3 不同起始蛋白濃度在11.5% PEG4000/20% NaH2PO4體系中的萃取行為

由表3可得，當牛血清白蛋白濃度為2 mg/mL時，分配系數(shù)K值為0.38最小，而下相回收率Y下為89.4%，達到最大.

2.4.2 PEG4000/(NH4)2SO4體系中牛血清白蛋白的萃取行為.

同上操作，結果見表4.

表4 不同起始蛋白濃度在12% PEG4000/17.5% (NH4)2SO4體系中的萃取行為

由表4可知，當牛血清白蛋白濃度為2 mg/mL時分配系數(shù)K值為0.29最小，而下相回收率Y下=91.5%，達到最大.

3 討 論

從相圖結果可以看出，同樣條件下PEG4000/NaH2PO4雙水相體系成相所需的PEG4000質量分數(shù)和鹽的質量分數(shù)都比較少，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于兩種體系的鹽的種類不同，使得兩種鹽的無機離子在兩相中分配系數(shù)不同，從而導致兩種體系成相的差異[9].

萃取蛋白時，上相是PEG4000，蛋白在PEG4000中不易分離；下相是無機鹽溶液，萃取蛋白后容易分離純化，而分配系數(shù)K是體現(xiàn)蛋白在上下兩相中分配情況的關鍵，所以取K值最小時，下相中分配蛋白最多，更利于蛋白后續(xù)的分離純化[10].

在不同的牛血清白蛋白起始濃度實驗中，兩種體系相比，可以得出PEG4000/(NH4)2SO4雙水相體系的分配系數(shù)K更小且回收率Y更高.其原因可能是因為磷酸鹽體系中的無機鹽NaH2PO4電離出氫離子使得體系的pH值更接近牛血清白蛋白的等電點4.7，從而使得蛋白的帶電更少，導致磷酸鹽體系的分配系數(shù)更大，回收率更小[11].而當兩種體系的牛血清白蛋白起始濃度由2 mg/mL升至3 mg/mL后，兩種體系的分配系數(shù)K值都增大，且回收率變小.這可能是由于蛋白濃度增大使得兩相黏度尤其是下相的黏度增加，并且可能會不同程度地擾亂成相系統(tǒng)，使得上下相體積比降低，從而影響蛋白質回收率[12].

本研究認為，在PEG4000和NaH2PO4及(NH4)2SO4組成的雙水相體系中，兩種體系均對牛血清白蛋白有較好的萃取率.本實驗結果可為后續(xù)利用雙水相萃取技術分離純化活性蛋白提供相關數(shù)據(jù).