劉 濤，楊 丹，鄭 燕，賀楨翔，張文靜，羅 虹，潘春暉，楊紅玉

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川德成動(dòng)物保健品有限公司，四川 德陽 618000)

0 引 言

參附注射液主要由紅參、黑附片提取物組成，其有效成分為人參皂苷、烏頭生物堿，主要用于治療元?dú)獯筇潯⑹肿阖世渑c頭暈氣短等癥[1].參附注射液于1987年上市，并于1992年被國家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)為醫(yī)院急診必備中成藥[2].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，參附注射液在臨床應(yīng)用過程中，通常會(huì)出現(xiàn)輕微不良反應(yīng).根據(jù)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》規(guī)定，參附注射液評定標(biāo)準(zhǔn)僅局限于薄層鑒別、烏頭類生物堿限量檢查及人參皂苷含量測定等，并沒有對其多個(gè)成分的全面評價(jià).研究表明，中藥指紋圖譜可以較充分地反映中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評價(jià)中[3-5].其中，紫外—可見指紋圖譜是中藥及其制劑質(zhì)量分析中常用的一種方法，具有靈敏性高、精密度好和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[6]，紅外指紋圖譜中建立的共有峰率和變異峰率兩個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，在二維參數(shù)空間中從相似性和差異性兩個(gè)方面可同時(shí)對中藥的質(zhì)量進(jìn)行分析，較一維參數(shù)空間具有更強(qiáng)的分辨能力[7]；物理指紋圖譜可對中藥注射液的質(zhì)量及穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)[8].故本研究擬采用紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜聯(lián)用的方法，以全面、直觀、有效地對參附注射液的質(zhì)量及穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià).

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：參附注射液(效期內(nèi)批號，160609、160611、161102、160601、161011、170702、160612、170105；效期外批號，150501、130719、130718)，由四川雅安三九藥業(yè)有限公司提供；溴化鉀(批號，20170526)，購自天津市卒越化學(xué)品有限公司；水為怡寶純凈水.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：Spectrum-II型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；PHS-3C型精密pH計(jì)、DDS-307型電導(dǎo)率儀(上海日島科學(xué)儀器有限公司)；E-201-C pH型復(fù)合電極(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱(成都雅源科技有限公司)；TU-1810PC型紫外—可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；SMC-30C型滲透壓摩爾濃度測定儀(天津天河醫(yī)療儀器有限公司)；WAY-2S型數(shù)字阿貝折射儀(上海申光儀器儀表有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外—可見指紋圖譜

2.1.1 供試品溶液的制備.

精密量取2.00 mL參附注射液(批號，160612)于50 mL量瓶中，加純凈水至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.1.2 光譜掃描條件.

用水作為空白對照，在波長200～800 nm下，以光譜帶寬2.00 nm，光度模式為Abs，掃描間隔為1.0 nm，進(jìn)行全波長掃描.

2.1.3 方法學(xué)考察.

按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)所確定的光譜掃描條件進(jìn)行掃描，得到圖譜后，用樣品的吸收波長對應(yīng)的吸光度計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察項(xiàng)下紫外—可見圖譜在297 nm、269 nm、243 nm波長處吸光度的RSD均小于5.0%.結(jié)果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求.

2.1.4 樣品圖譜的采集及對照圖譜的建立.

取8批參附注射液，按“2.1.1”項(xiàng)下所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)所確定的光譜掃描條件進(jìn)行掃描，得到8批參附注射液的紫外—可見疊加圖譜，結(jié)果見圖1，并取其吸光度的平均值得到對照紫外—可見指紋圖譜，結(jié)果見圖2.

圖1 8批參附注射液紫外—可見光譜疊加圖

2.1.5 吸光度值限度.

8批有效期內(nèi)的參附注射液的紫外—可見圖譜于297 nm、269 nm、243 nm波長下的吸光度值結(jié)果見表1.

由表1可知，有效期內(nèi)的參附注射液，按照“2.1.1”項(xiàng)所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2"項(xiàng)所確定的光譜掃描條件掃描，所得紫外—可見圖譜吸光度值應(yīng)同時(shí)分別滿足297 nm(0.330～0.460)、269 nm(0.587～0.734)、243 nm(0.520～0.630).

圖2 參附注射液對照紫外—可見指紋圖譜

2.1.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

按照“2.1.1”項(xiàng)所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)所確定的光譜掃描條件掃描.結(jié)果表明，3批效期外參附注射液樣品中，其吸光度值不符合限度要求.

2.2 紅外指紋圖譜

2.2.1 測試條件.

精密吸取參附注射液50 μL于瑪瑙研缽中，揮干，加入0.1 g溴化鉀，研磨均勻后，壓片，在紅外光譜儀中測定，測定區(qū)域?yàn)? 000～450 cm-1.

2.2.2 方法學(xué)考察.

按照“2.2.1”項(xiàng)下的測試條件進(jìn)行測定，計(jì)算圖譜中4個(gè)特征吸收波數(shù)處透光率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.經(jīng)考察，測得精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性項(xiàng)下4個(gè)特征吸收波數(shù)所對應(yīng)透光率RSD均小于5.0%.結(jié)果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求.

2.2.3 不同批次參附注射液紅外指紋圖譜的采集.

11批不同批次參附注射液的紅外指紋圖譜如圖3所示.

2.2.4 紅外指紋圖譜共有峰和變異峰的確定.

在紅外指紋圖譜中，對于不同圖譜的共有峰可以采用正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn).通過檢驗(yàn)后，若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差異顯著小于其相鄰組之間的平均波數(shù)差，可將其確定為是一組共有峰，相反則為變異峰.共性識(shí)別指標(biāo)為:共有峰率，P=(Ng/Nd)×100%；變異峰率，Pva=(na/Ng)×100%；Pvb=(nb/Ng)×100%，Nd=Ng+na+nb.其中Pva、Pvb、Ng、Nd、na、nb分別為a圖譜的變異峰率、b圖譜的變異峰率、2圖譜中共有峰數(shù)、獨(dú)立峰數(shù)、a圖譜的變異峰數(shù)、b圖譜的變異峰數(shù).

圖3 11批參附注射液紅外光譜疊加圖

2.2.5 指紋圖譜共有峰識(shí)別及雙指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)建立.

根據(jù)紅外指紋圖譜測定數(shù)據(jù)，以各樣品為參考，利用紅外指紋圖譜變異峰率及共有峰率計(jì)算公式計(jì)算出樣品之間的變異峰率及共有峰率，按照不同批次參附注射液共有峰率大小排成n維序列片段，該系列稱為共有峰率和變異峰率的雙指標(biāo)序列.通過該雙指標(biāo)序列可以衡量不同批次樣品之間相似度，選取效期內(nèi)的8批參附注射液，建立共有峰率及變異峰率標(biāo)準(zhǔn)范圍，結(jié)果如表2所示.

由表2可知，參附注射液的共有峰率為54.83%～91.67%，變異峰率為0.00%～52.94%.

2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

取3批效期外參附注射液，根據(jù)紅外指紋圖譜測定數(shù)據(jù)，以各樣品為參考，利用紅外指紋圖譜變異峰率及共有峰率計(jì)算公式計(jì)算出樣品之間的變異峰率及共有峰率，按照不同批次參附注射液共有峰率大小排成n維序列片段.結(jié)果表明，效期外3批參附注射液共有峰率最低為51.72%，變異峰率最高為53.33%，其中，1批不符合限度要求，其余2批均符合限度要求.

2.3 物理指紋圖譜

2.3.1 物理質(zhì)量指標(biāo)的測定方法.

參附注射液物理指紋圖譜中參數(shù)的測定首選法定標(biāo)準(zhǔn)收載方法[8-9]，其相關(guān)指標(biāo)包括：氫離子濃度指數(shù)(pH)、電導(dǎo)率(G)、相對密度(d)、運(yùn)動(dòng)黏度(v)、固含物(M)、濁度(T)、滲透壓摩爾濃度(O)、折光率(n).

表2 8批參附注射液紅外指紋圖譜共有峰及變異峰率/%

2.3.2 物理質(zhì)量指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換.

由于用于構(gòu)建物理指紋圖譜的8個(gè)物理參數(shù)的數(shù)值和量綱不同，為了方便定量直觀地利用雷達(dá)圖進(jìn)行展示，參考藥典標(biāo)準(zhǔn)和物理化學(xué)參數(shù)手冊，確定每個(gè)指標(biāo)的可能數(shù)值范圍，然后將其標(biāo)準(zhǔn)化至同一尺度，即0～10.參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換見表3.

表3 參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

2.3.3 參附注射液對照物理指紋圖譜的構(gòu)建.

8批效期內(nèi)參附注射液，按照“2.3.1”項(xiàng)下確定的方法測定供試品各物理參數(shù)，并對其數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果見表4,并以8批參附注射液各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化物理參數(shù)的平均值作雷達(dá)圖，即得到對照物理指紋圖譜,結(jié)果見圖4.

表4 參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換

圖4參附注射液對照物理指紋圖譜

2.3.4 物理參數(shù)限度要求.

8批效期內(nèi)參附注射液的8 個(gè)物理參數(shù)值及標(biāo)準(zhǔn)化值的范圍如表3所示.這8批效期內(nèi)的參附注射液，按照“2.3.1”項(xiàng)所確定的方法測定供試品，所得物理指紋譜，可用于評價(jià)其他批次參附注射液的各個(gè)指標(biāo)是否同時(shí)滿足表4中的標(biāo)準(zhǔn)化范圍.

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

按照“2.3.1"項(xiàng)所確定的方法測定3批效期外樣品，所得物理指紋圖譜8個(gè)參數(shù)值.結(jié)果表明，3批效期外參附注射液樣品的物理指紋圖譜8個(gè)物理參數(shù)值基本不在標(biāo)準(zhǔn)化值范圍內(nèi)，因此不符合標(biāo)準(zhǔn).

3 討 論

目前，參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司獨(dú)家生產(chǎn)，因此不能比較不同廠家的質(zhì)量差異，此外在建立其指紋圖譜時(shí)，8批參附注射液中生產(chǎn)批次時(shí)間相近.其中，紫外—可見指紋圖譜，其吸光度值可以規(guī)定其范圍，紅外指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)共有峰率最低可達(dá)54.83%，最高可達(dá)91.67%，變異峰率最高為52.94%，物理指紋圖譜中標(biāo)準(zhǔn)范圍較廣.研究表明，參附注射液即使由同一個(gè)廠家生產(chǎn)且生產(chǎn)批次相近，也可能存在質(zhì)量上的差異，其原因可能是參附注射液中的某一成分不穩(wěn)定而造成的，具體成分還有待進(jìn)一步驗(yàn)證.

在本研究的指紋圖譜方法學(xué)建立采用的是8批效期內(nèi)參附注射液，而批次數(shù)量也能從一定程度上反應(yīng)樣品的整體情況.3批效期外參附注射液的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，紫外—可見指紋圖譜吸光度值均不符合要求，紅外指紋圖譜中有1批樣品的共有峰率與變異峰率超出其允許范圍，物理指紋圖譜中3批樣品均不符合要求.由此可見，紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜均能全面地反應(yīng)過期與非過期樣品的質(zhì)量差異.

本研究將紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜運(yùn)用到參附注射液質(zhì)量評價(jià)中，初步確定了其標(biāo)準(zhǔn)范圍，以從整體上控制參附注射液質(zhì)量，改變了以單一化學(xué)成分的定性及定量控制產(chǎn)品質(zhì)量模式，提升了參附注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).研究結(jié)果也表明，紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜法聯(lián)用的方法對液體藥物質(zhì)量評價(jià)具有一定的研究意義.