曾春生 曾紅學(xué) 黃作超 等

[摘要]目的 探究欖香烯乳對宮頸癌HeLa細(xì)胞的放射增敏作用，為其在宮頸癌放射治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 將欖香烯乳未處理組作為對照組，欖香烯乳處理組作為治療組。通過克隆形成實驗、流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞增殖、凋亡能力及細(xì)胞周期分布、細(xì)胞免疫熒光檢測Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá);制備裸鼠HeLa細(xì)胞種植瘤模型，給予欖香烯乳及不同劑量射線照射后，計算種植瘤的體重及體積變化，分析欖香烯乳對HeLa細(xì)胞放射增敏作用。結(jié)果 當(dāng)欖香烯乳濃度≥40 μg/ml時，能顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并通過促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)。不同放射劑量射線下，治療組HeLa細(xì)胞或種植瘤均較對照組生長抑制明顯。結(jié)論 欖香烯乳能顯著提高HeLa細(xì)胞的放射敏感性。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌;HeLa細(xì)胞;欖香烯乳;放射增敏

[中圖分類號] R737.33? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of elemene on radiosensitization of cervical cancer HeLa cells and provide evidence for its clinical application in radiotherapy of cervical cancer. Methods The untreated group of elemene was the control group， and the elemene treatment group was the treatment group. The proliferation， apoptosis and cell cycle distribution of HeLa cells were detected by colony formation assay and flow cytometry. The expression of Bax and Bcl-2 protein was detected by immunofluorescence. The implanted tumor model of HeLa cells in nude mice was used to give elemene emulsion and after different doses of radiation， the body weight and volume changes of implanted tumors were calculated， and the radiosensitizing effect of elemene emulsion on HeLa cells was analyzed. Results When the concentration of elemene was ≥40 μg/ml， it could significantly inhibit the proliferation of HeLa cells and promote apoptosis， and promote the regulation of Bax expression and inhibit the expression of Bcl-2. Under different radiation doses， HeLa cells or implanted tumors in the treatment group were significantly inhibited by growth inhibition compared with the control group. Conclusions Elemene can significantly increase the radiosensitivity of HeLa cells.

[Key words] Cervical cancer; HeLa cells; Elemene; Radiosensitization

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年大約有50萬新發(fā)病例，80%的新發(fā)病例在發(fā)展中國家[1]。我國是宮頸癌高發(fā)國之一，患病率和死亡率均約占全世界1/3[2]。近年來宮頸癌的發(fā)病率有上升趨勢，尤其在年輕女性宮頸癌發(fā)病率逐年提高，且中、晚期患者較多，預(yù)后不佳[3]。宮頸癌的主要治療手段為放療、手術(shù)，手術(shù)為主的綜合治療僅限于Ⅱa期以早的病例，宮頸癌一般發(fā)現(xiàn)時分期較晚，喪失了最佳手術(shù)治療的機會，因此放療在宮頸癌的治療中起著十分重要的作用[4-6]。

提高腫瘤細(xì)胞對放射線的敏感性，在適當(dāng)降低放療總劑量的同時，提高腫瘤治愈率及減少并發(fā)癥、后遺癥，一直是臨床研究的重點。近年來，欖香烯抗腫瘤方面的作用得到較多關(guān)注，但一般作為化療輔助藥物[7-9]，放療增敏的研究報道較少。本文通過欖香烯乳對宮頸癌HeLa細(xì)胞和裸鼠移植瘤的放射增敏作用的研究，為其在宮頸癌放射治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、類胎牛血清（Hyclone公司）、100×青-鏈霉素（杭州昊天生物技術(shù)有限公司）;細(xì)胞凋亡試劑盒（聯(lián)科生物公司）;DAPI（Sigma，D9452）、Bax antibody（Abcam，ab32503）、Bcl-2 antibody（Abcam，ab32124）、Alexa FluorR 488 Donkey anti-rabbit IgG （Life，1723019）、欖香烯注射液（大連華立金港藥業(yè)有限公司，規(guī)格：20 ml∶0.1 g/支，批號：1508161，有效期至2018年7月）、戊巴比妥鈉（SIGMA，140418）、Ⅸ 73型顯微鏡（OLYMPUS公司）、ECLIPSE Ti-S型倒置顯微鏡（Nikon公司）、Hela細(xì)胞（赫貝科技細(xì)胞庫復(fù)蘇）。

1.2實驗方法

1.2.1克隆形成實驗

1.2.1.1細(xì)胞增殖部分? 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，每孔500個細(xì)胞。加入含不同濃度（0、10、20、40、80、160 μg/ml）的欖香烯乳培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)后培養(yǎng)板置于光鏡下觀察，計數(shù)>50個細(xì)胞數(shù)的集落數(shù)。按以下公式計算：藥物作用后集落存活率=某一濃度藥物組作用后集落數(shù)/該組細(xì)胞種植數(shù)。一共6組，每組3個重復(fù)，1個時間點。

1.2.1.2放射增敏部分? 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，每孔1000個細(xì)胞;加入或不加入40 μg/ml的欖香烯乳培養(yǎng)液培養(yǎng);24 h貼壁后再用銥192核素進(jìn)行輻射，分別輻射0、0.5、1、1.5、2 Gy。培養(yǎng)15 d后，將培養(yǎng)板置于光鏡下觀察，結(jié)晶紫染色，計數(shù)>50個細(xì)胞數(shù)的集落數(shù)。按以下公式計算：藥物作用后集落存活率=某一濃度藥物組作用后集落數(shù)/該組細(xì)胞種植數(shù)。一共6組，每組3個重復(fù)，1個時間點。

1.2.2細(xì)胞凋亡檢測

取生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞，鋪6孔板，每孔加入1×105個細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中靜置24 h。用40 μg/ml的欖香稀乳處理HeLa細(xì)胞，于24 h和48 h后收集細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡。藥物作用后，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次，用500 μl 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，輕輕混勻后于4℃避光條件下孵育5 min，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光檢測

取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以每孔5×104個細(xì)胞種植至24孔板，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁。①對照1組：不做任何處理，正常培養(yǎng)。②24 h培養(yǎng)組：加入40 μg/ml的欖香烯乳培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。③48 h培養(yǎng)組：加入40 μg/ml的欖香烯乳培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。各組細(xì)胞，PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min;PBS洗3次，0.5%的Triton室溫破膜20 min;PBS洗3次，5%的BSA室溫封閉1 h;PBS洗3次，分別加入相應(yīng)一抗，4℃過夜;PBS洗3次，分別加入相應(yīng)熒光二抗，室溫避光孵育1 h;PBS洗3次，加入10 nm濃度的DAPI染料，室溫避光孵育5 min;PBS洗3次。在200倍熒光顯微鏡下，觀察蛋白熒光強度。

1.2.4實驗動物及飼養(yǎng)條件

實驗動物：30只4～5周齡裸鼠由上海萊克斯實驗動物有限責(zé)任提供，接收時動物體重為16～18 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002，合格證號：0278762，SPF級。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對濕度范圍40%～70%。

1.2.5荷瘤的小鼠制備及其處理方法

取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，以1 ml空針將細(xì)胞懸液吹打混勻后，取0.2 ml接種于裸鼠右側(cè)腹股溝皮下，含細(xì)胞數(shù)4×105個/只。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長過程及裸鼠狀況，待腫瘤生長至直徑>1 cm時，30只荷瘤裸鼠按腫瘤體積隨機分為兩組，即：治療組和對照2組，每組各15只。治療組腹腔內(nèi)注射欖香烯，劑量為100 mg/kg，對照組給予0.2 ml生理鹽水。兩組動物分別于1、4、7、10、13、16、19、22 d給藥，每次給藥前稱量鼠重，調(diào)整給藥劑量，同時測量腫瘤體積，并分別于第4、7、10、13、16、19、22 d給藥后2 h進(jìn)行放療，條件為：裸鼠仰臥位固定，腹股溝部照射野大小為2 cm×3 cm（根據(jù)腫瘤大小進(jìn)行調(diào)整），腫瘤表面覆蓋厚填充物，銥192核素照射，照射劑量為DT 2 Gy/F，3 min。

1.2.6檢測指標(biāo)

各組裸鼠于給藥后第3天稱重并測量瘤塊體積，1次/3 d，用游標(biāo)卡尺測量瘤體的最長徑（a）和最短徑（b），計算腫瘤體積（V），單位cm3，V=1/2 ab2=0.5 ab2，繪制腫瘤生長曲線。動物體重：每3天測量1次動物總重，動物體重=總重-腫瘤體積（假設(shè)腫瘤密度為1）。處死動物，分別稱體重和瘤重，計算：瘤體積抑制率=（1-試驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積）×100%;瘤重抑制率=（1-試驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%，停止照射后3 d，處死裸鼠，剝離腫瘤，部分-80℃保存，部分4%甲醛固定，用于后續(xù)檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;采用Graph Pad Prism統(tǒng)計軟件進(jìn)行多組均數(shù)分析，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，用多個劑量組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計;計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1欖香烯乳對HeLa細(xì)胞增殖能力的影響

2.2欖香烯乳對HeLa細(xì)胞周期及凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡，分析發(fā)現(xiàn)欖香烯可改變HeLa細(xì)胞周期的分布，當(dāng)40 μg/ml欖香烯處理48 h后，G2/M期細(xì)胞比例低于處理0 h，凋亡率高于處理0 h;處理24 h后，G1期細(xì)胞比例高于處理0 h，S期細(xì)胞比例低于處理0 h;處理48 h后，G1期細(xì)胞比例低于處理0 h，S期細(xì)胞比例高于處理0 h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示欖香烯可使Hela細(xì)胞周期阻滯于S期，阻斷細(xì)胞由S期向G2/M期的進(jìn)程，阻滯細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，促使HeLa細(xì)胞凋亡（表1）。

2.3欖香稀乳對HeLa細(xì)胞Bcl-2和BAX表達(dá)的影響