楊洲 剛海菊 覃先蓬 賈貴清 周曉剛 趙高平 高本領(lǐng)

(1四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610000；2成都市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)分院護(hù)理教研室；3廣元市蒼溪縣中醫(yī)院)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，是世界上僅次于肺癌和乳腺癌的第3大常見(jiàn)腫瘤〔1，2〕。不論早期或晚期，結(jié)直腸癌的臨床癥狀均不明顯或不典型，因而容易被患者及臨床醫(yī)生所忽略，一旦確診多為晚期，錯(cuò)過(guò)治療的最佳時(shí)機(jī)，患者多呈現(xiàn)轉(zhuǎn)移或手術(shù)切除易復(fù)發(fā)致死〔3〕。如何早診斷及早治療是結(jié)直腸癌的解決關(guān)鍵。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，人們對(duì)結(jié)直腸癌的研究焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到基因?qū)用妗Ｎ⑿『颂呛怂?miRNAs)是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切的一類小分子RNA，屬于非編碼的單鏈小分子RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控〔4〕。miRNAs與腫瘤關(guān)系的研究主要在以下幾方面：①miRNAs主要位于基因組不穩(wěn)定區(qū)域及癌相關(guān)區(qū)域；②miRNAs在正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)不同，幾乎所有的惡性腫瘤均呈異常表達(dá)。研究表明，miRNAs中既有致癌基因也有抑癌基因，通過(guò)參與調(diào)控細(xì)胞周期從而引發(fā)腫瘤〔5，6〕。另外，文獻(xiàn)顯示特定富含AT堿基DNA序列結(jié)合蛋白(SATB)2的低表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)〔7,8〕。但關(guān)于結(jié)直腸癌中靶向調(diào)控SATB2的miRNAs研究和報(bào)道還較少。本研究主要分析結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與靶向調(diào)控SATB2的相關(guān)miRNAs的內(nèi)在聯(lián)系，為結(jié)直腸癌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象 收集四川省人民醫(yī)院病理科2015年9～10月收集的所有手術(shù)切除的結(jié)直腸標(biāo)本，病檢確診為結(jié)直腸癌的標(biāo)本6例為實(shí)驗(yàn)組，正常結(jié)直腸標(biāo)本6例為對(duì)照組。從距離標(biāo)本中心≤1 cm的組織提取RNA，制作成12株細(xì)胞株，保存于-80℃冰箱。兩組標(biāo)本的性別、年齡和體重指數(shù)等參數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。BALB/C 裸鼠，雌雄各半，購(gòu)自上海腫瘤研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0024556。結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480均購(gòu)自上海素爾生物科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 TDM熒光偏振免疫自動(dòng)分析儀(上海金鵬分析儀有限公司)，ABI7300熒光定量PCR儀上海智巖科學(xué)儀器有限公司，LT-16alpha 恒溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè)系統(tǒng)儀(北京藍(lán)譜生物科技有限公司)。CCK8(日本同仁化學(xué)公司)，其余試劑均由強(qiáng)森科技提供。SATB2單克隆抗體(美國(guó)ABI公司)，Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，PrimeScript RT reagent Kit試劑盒(美國(guó)Promega公司)和TaqMan@MicroRNA Assay試劑盒(美國(guó)ABI公司)，RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司)。

1.3研究方法

1.3.1篩選靶向調(diào)控SATB2候選miRNAs 利用miRBase、TargetScan和PicTar 3個(gè)常用的miRNA靶基因，結(jié)合miRNAs的芯片結(jié)果，使用預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，在靶向調(diào)控SATB2基因結(jié)直腸區(qū)域的12株細(xì)胞株中選擇候選miRNAs。

1.3.2測(cè)定候選miRNA表達(dá) 利用RT-PCR技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)，測(cè)定結(jié)直腸癌細(xì)胞系、結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸組織及細(xì)胞中miRNA表達(dá)。

1.3.3檢測(cè)miRNAs對(duì)調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SATB2的靶效性 根據(jù)候選miRNAs預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建SATB2基因3′UTR突變性和野生型熒光素酶載體，與miRNA抑制物轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因檢測(cè)和miRNA模擬物等技術(shù)手段相結(jié)合，檢驗(yàn)候選miRNA是否對(duì)SATB2基因表達(dá)有靶向調(diào)控作用，確定miRNAs對(duì)調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SATB2的靶效性。

1.3.4平板克隆實(shí)驗(yàn) 慢病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31和miR-182的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480/miR-31和SW480/ miR-182，以共同的空白細(xì)胞為對(duì)照SW480/Con。取細(xì)胞株，采用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化吹打成單個(gè)細(xì)胞并置于10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，稀釋、接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2～3 w，當(dāng)可通過(guò)肉眼觀察到培養(yǎng)皿中的克隆時(shí)，培養(yǎng)停止。棄上清液、浸洗并染色，放置在帶網(wǎng)格的透明膠片，對(duì)>10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)通過(guò)顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

1.3.5細(xì)胞周期檢測(cè) 將SW480/miR-31、SW480/miR-182和對(duì)照SW480/Con細(xì)胞株消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心、棄上清，浸洗、沉淀，于4℃固定24 h，離心、浸洗，加入500 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)含50 μg/ml溴化啶(PI)、100 μg/ml RNaseA、0.2%TritonX-100，避光孵育30 min上機(jī)。

1.3.6熒光素酶活性檢測(cè) 根據(jù)構(gòu)建的基因檢測(cè)系統(tǒng)，即突變型SATB2基因3′UTR系統(tǒng)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-31和miR-182后細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性。

1.3.7測(cè)定SATB2的逆轉(zhuǎn)作用 SATB2基因轉(zhuǎn)染后，采用CCK8增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)降低miR-31及miR-182表達(dá)的細(xì)胞體外增殖能力。慢病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480得到穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31和miR-182的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480/miR-31和W480/ miR-182，以共同的空白細(xì)胞為對(duì)照SW480/Con。采用CCK8試劑盒法，收集SW480/miR-31和SW480/miR-182細(xì)胞及SW480/Con的細(xì)胞種植于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后(4～12 h)加藥，5%CO2，37℃孵育12 h，每孔中加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分析。

1.3.8細(xì)胞周期 SATB2基因轉(zhuǎn)染后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)DLD1/miR-31和SW480/miR-31細(xì)胞的周期。

1.3.9運(yùn)動(dòng)能力 SATB2轉(zhuǎn)染后，采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。

1.3.10裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 取皮下瘤組織進(jìn)盲腸原位移植于裸鼠皮下，作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組皮下注射生理鹽水，分別為6只/組，2 w后處死，測(cè)定瘤的最大直徑和重量，采用免疫組化法檢測(cè)瘤體的miR-31和miR-182的表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1候選miRNA篩選 預(yù)測(cè)SW480細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜和靶向調(diào)控SATB2基因的miRNAs生物信息學(xué)結(jié)果并進(jìn)行分析，與SATB23′UTR的保守區(qū)相比較，SW480細(xì)胞的miR-182(0.8±0.2 vs 0.4±0.2，t=3.464，P=0.018)、miR-26(0.9±0.3 vs 0.5±0.2，t=2.717，P=0.042)及miR-31(0.9±0.2 vs 0.3±0.2，t=5.196，P=0.003)表達(dá)水平升高明顯。導(dǎo)入miR-31和miR-182模擬物后，降低SW480細(xì)胞內(nèi)SATB2表達(dá)水平(1.2±0.3 vs 0.8±0.2，t=2.717，P=0.042，n=6；0.9±0.2 vs 0.5±0.2，t=3.464，P=0.018，n=6)，而將其抑制物導(dǎo)入后，可明顯增加SW480細(xì)胞中的SATB2表達(dá)(1.2±0.3 vs 1.7±0.3，t=2.887，P=0.034，n=6；0.9±0.2 vs 1.5±0.4，t=3.286，P=0.022，n=6)。將miR-27b的抑制物和模擬物導(dǎo)入，SW480細(xì)胞內(nèi)SATB2表達(dá)無(wú)明顯改變(1.2±0.3 vs 1.0±0.3，t=1.155，P=0.300，n=6；0.9±0.2 vs 0.7±0.2，t=1.732，P=0.144，n=6；1.2±0.3 vs 0.9±0.3，t=1.732，P=0.144，n=6；0.9±0.2 vs 0.6±0.3，t=2.038，P=0.097，n=6)，因此miR-31和miR-182是本次實(shí)驗(yàn)考察調(diào)控SATB2候選miRNAs。

2.2結(jié)直腸組織miR-31和miR-182的表達(dá)差異 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組癌組織中miR-182和miR-3表達(dá)明顯偏高(2.8±0.9 vs 0.3±0.2，t=6.642，P=0.000，n=6；2.4±0.5 vs 0.5±0.3，t=7.982，P=0.000，n=6)。實(shí)驗(yàn)組中3例無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移，3例淋巴轉(zhuǎn)移，與無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移相比，有淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中miR-31和miR-182表達(dá)明顯高偏高 (4.5±1.0 vs 1.1±0.8，t=4.599，P=0.044，n=3；4.1±1.1 vs 0.7±0.6，t=4.700，P=0.042，n=3)。

2.3SW480/miR-31和SW480/miR-182細(xì)胞增殖能力 SW480/miR-31和SW480/miR-182細(xì)胞的增殖能力〔(1.6±0.4)%，(1.5±0.4)%，n=6〕明顯高于對(duì)照SW480/Con〔(0.9±0.4)%,n=6,t=3.429,P=0.019;t=2.598,P=0.048〕。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖可見(jiàn)圖1。

圖1 增殖狀態(tài)下的SW480/miR-31細(xì)胞

2.4SW480/miR-31和SW480/miR-182的平板克隆實(shí)驗(yàn) SW480/miR-31〔(4.3±1.2)%〕和SW480/miR-182細(xì)胞〔(4.0±1.1)%〕形成的克隆較對(duì)照SW480/Con細(xì)胞多〔(2.1±1.0)%，t=3.450，P=0.018;t=3.131，P=0.026，n=6〕，見(jiàn)圖2。

2.5SW480/miR-31和SW480/miR-182的細(xì)胞周期 與SW480/Con細(xì)胞G0/G1期(76.17%)、S期(14.36%)及G2/M期(9.47%)比較，SW480/miR-31，停留在G0/G1期的細(xì)胞減少(64.15%)，S期的細(xì)胞增多(24.60%)，G2/M期細(xì)胞增多(11.25%)，SW480/miR-182，G0/G1期(62.17%)的細(xì)胞減少，S期(24.38%)細(xì)胞增多，G2/M期(13.45%)細(xì)胞增多。

圖2 SW480/miR-31和SW480/Con細(xì)胞克隆數(shù)比較

2.6SW480/miR-31和SW480/miR-182的熒光素酶活性 與對(duì)照SW480/Con細(xì)胞比較，SW480/miR-31和SW480/miR-182的細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性(3.4±0.8 vs 1.5±0.5，t=4.933，P=0.004，n=6；2.7±0.6 vs 1.6±0.4，t=3.737，P=0.013，n=6)明顯降低，SATB2的表達(dá)(2.4±1.0 vs 0.9±0.5，t=3.286，P=0.022，n=6；2.5±1.1 vs 0.7±0.4，t=3.767,P=0.013，n=6)降低。

2.7SATB2的逆轉(zhuǎn) SATB2基因轉(zhuǎn)染后，miR-31和miR-182細(xì)胞體外增殖能力均明顯降低〔(1.5±0.5)% vs (0.7±0.3)%，t=3.361，P=0.020，n=6；(1.6±0.5)% vs (0.8±0.4)%，t=3.060，P=0.028，n=6〕。

2.8SATB2基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期 與SW480/Con細(xì)胞G0/G1期(36.45%)、S期(27.95%)、G2/M期(20.14%)比較，SATB2基因轉(zhuǎn)染后，SW480/miR-31和SW480/miR-182細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期(75.16%、76.45%)增多，S期(11.35%、18.36%)細(xì)胞減少，G2/M期(13.48%、5.19%)細(xì)胞減少。

2.9運(yùn)動(dòng)能力 SATB2轉(zhuǎn)染后，SW480/miR-31和SW480/miR-182細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力明顯降低〔(3.7±1.0)cm vs (1.8±0.6)cm，t=3.991，P=0.010，n=6；(3.6±1.2)cm vs (1.5±0.7)cm，t=3.703，P=0.014，n=6〕。

2.10裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的瘤體積和瘤重量均明顯增高〔(23.1±3.8)mm3vs (146.5±17.8)mm3，t=16.607，P=0.000，n=6；(1.0±0.3)g vs (2.9±0.5)g，t=7.982，P=0.000，n=6〕。

2.11裸鼠成瘤的miR-31和miR-182表達(dá)結(jié)果 與對(duì)照組比，實(shí)驗(yàn)組瘤的miR-31和miR-182表達(dá)均明顯增高(1.2±0.6 vs 3.9±0.9，t=6.114，P=0.001，n=6；1.0±0.4 vs 2.8±0.6，t=6.114，P=0.002，n=6)，見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)組裸鼠體內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，淋巴轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、腹腔轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移，對(duì)照組裸鼠無(wú)轉(zhuǎn)移病灶。

A和B：實(shí)驗(yàn)組的miR-31和miR-182；D和E：對(duì)照組的miR-31和miR-182圖3 裸鼠成瘤皮下miR-31和miR-182表達(dá)(×100)

3 討 論

結(jié)腸鏡檢查和糞便隱血試驗(yàn)是結(jié)直腸癌主要的兩種篩查方法〔9〕。結(jié)腸鏡檢查是結(jié)直腸癌診斷的金指標(biāo)，可在鏡下摘除病理組織送病檢，但該方法具有侵入性，成本較高；糞便隱血試驗(yàn)可以幫助早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌，而且使用廣泛、費(fèi)用較低，但敏感性和特異性均較低。因此急需探求新的診斷方法，以更好地對(duì)患者進(jìn)行早期診斷和治療。SATB2的特異AT 序列，是較重要的核基質(zhì)結(jié)合蛋白的一種，與核基質(zhì)附著區(qū)相結(jié)合，促進(jìn)染色質(zhì)重建和基因重組〔10〕。SATB2能通過(guò)甲基化水平和蛋白乙?；韧緩秸{(diào)控基因的表達(dá)，在腫瘤轉(zhuǎn)移、凋亡調(diào)控及免疫調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮著重要作用〔11〕。因在外周血中發(fā)現(xiàn)高濃度穩(wěn)定的miRNAs和其在不同腫瘤中的異常表達(dá)，miRNAs有潛力作為結(jié)直腸癌早期篩查的非侵入性標(biāo)志物〔12〕。已有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)在多數(shù)腫瘤中存在特異的miRNAs的異常表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于同一腫瘤個(gè)體不同組織的miRNAs的表達(dá)水平也有所不同，從而發(fā)揮抑癌基因或致癌基因作用〔13〕。本研究結(jié)果顯示，miR-31和miR-182能負(fù)性調(diào)控SATB2的表達(dá)，結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與否與miR-31和miR-182密切相關(guān)，作用機(jī)制可能在于結(jié)直腸過(guò)表達(dá)miR-31和miR-182后，SW480細(xì)胞中的間葉標(biāo)志物釋放的神經(jīng)鈣黏素(N-Cadherin)增加，癌細(xì)胞的黏附能力、生存能力及運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。miR-31和miR-182能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并減少癌細(xì)胞凋亡，與結(jié)直腸的發(fā)生密切相關(guān)，由此可見(jiàn)通過(guò)觀察miR-31或miR-182的表達(dá)，有助于判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。SATB2能抑制miR-31和miR-182的體外繁殖和運(yùn)動(dòng)能力，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，減少癌細(xì)胞擴(kuò)散。體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中將細(xì)胞懸液注射于裸鼠體內(nèi)，觀察到miR-31和miR-182大量表達(dá)，裸鼠大量發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，而對(duì)照細(xì)胞組裸鼠無(wú)轉(zhuǎn)移灶形成，可能機(jī)制在于miR-31和miR-182大量表達(dá)，SW480細(xì)胞中的間葉標(biāo)志物能釋放較多的促癌細(xì)胞分化因子波形蛋白(Vimentin)和Ki-67，進(jìn)一步佐證miR-31和miR-182能通過(guò)抑制結(jié)直腸組織SATB2的表達(dá)，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移〔14,15〕。綜上所述，miR-31和miR-182在結(jié)直腸癌中高表達(dá)與SATB2表達(dá)具有顯著性相關(guān)，miR-31和miR-182可直接通過(guò)調(diào)控SATB2影響結(jié)直腸癌的增長(zhǎng)侵襲。