李港澳 李侃 陳超 莊文欣 趙盛男 呂娥 付文玉

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1 2015級(jí)生物技術(shù)專業(yè)，山東 濰坊 261053；2 2016級(jí)生物技術(shù)專業(yè)；3醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心；4 2015級(jí)藥學(xué)專業(yè)；5組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)

帕金森病(PD)是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，平均發(fā)病年齡為60歲左右。其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)平衡障礙等，同時(shí)伴有大量非運(yùn)動(dòng)癥狀。PD的基本病理變化是黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡，由此引起紋狀體DA含量明顯減少而致病〔1〕。作為一種高病殘率、低病死率的神經(jīng)退行性疾病，PD嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量〔2〕。目前，PD的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但已有研究表明與遺傳、免疫炎癥反應(yīng)、衰老、氧化應(yīng)激等有關(guān)。中藥制劑腦血疏口服液(NXS)已廣泛應(yīng)用于治療腦缺血性疾病，其主要作用為改善神經(jīng)功能、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的能力、保護(hù)腦細(xì)胞等〔3〕。本課題組前期研究結(jié)果表明，NXS能夠抑制PD大鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活并減少炎性因子的表達(dá)，并未深入研究其抗炎機(jī)制〔4〕。p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)通路是重要的神經(jīng)炎癥調(diào)控通路之一，可激活下游核因子(NF)-κB，并進(jìn)而誘導(dǎo)多種促炎因子包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的過量表達(dá)〔5〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究NXS是否通過調(diào)節(jié)p38MAPK通路抑制PD大鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague Dawley大鼠(體重230～270 g)，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司〔SCXK(魯)20140007〕。

1.2主要試劑與儀器 NXS由山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20070059)；6-羥多巴胺(OHDA)、阿樸嗎啡(APO)、小鼠抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體均為Sigma公司產(chǎn)品，兔抗大鼠p38MAPK和NF-κB p65多克隆抗體為Arigo公司產(chǎn)品；兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體為Cell Signaling Technology產(chǎn)品；兔抗大鼠iNOS多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。腦立體定位儀(KOPF，美國(guó))，微量移液器、低溫高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，CM1950冰凍切片機(jī)(LEICA，德國(guó))，Olympus BX53正置熒光顯微鏡(Olympus，日本)，Nanoddrop 2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))。

1.3模型制備 按照本實(shí)驗(yàn)室以往采用的方法制備大鼠PD模型〔6〕。

1.4行為學(xué)檢測(cè)及分組 分別于紋狀體注射6-OHDA后第3周及大鼠灌胃30 d后，腹腔注射APO(0.5 ml/kg)誘導(dǎo)并觀察大鼠的旋轉(zhuǎn)行為。若大鼠出現(xiàn)以健側(cè)前肢或后肢為支點(diǎn)，首尾相接、身體環(huán)曲，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)，并伴有覓食樣嗅探等行為。連續(xù)觀察20 min，記錄大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)，平均旋轉(zhuǎn)速度以3～5 r/min為成功模型。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、NXS組〔NXS灌胃，2.36 g/(kg·d)，共30 d〕，每組10只。另取10只正常大鼠作為對(duì)照組。對(duì)照組和模型組均以同樣體積的生理鹽水代替NXS灌胃。

1.5免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黑質(zhì)TH、小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba1)、NF-κB、iNOS和p38MAPK的表達(dá) 隨機(jī)選取各組大鼠5只，腹腔注射7%水合氯醛麻醉，經(jīng)左心室依次灌注溫生理鹽水及4%多聚甲醛固定液，斷頭取腦，置于固定液中后固定48 h(4℃)。經(jīng)20%、25%、30%蔗糖磷酸鹽緩沖液梯度脫水，聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(OCT)包埋，中腦黑質(zhì)部位連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚10 μm。腦切片經(jīng)微波枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)后，按生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行染色。一抗抗體分別為TH(1∶800)、Iba1(1∶100)、NF-κB(1∶200)、iNOS(1∶100)、p38MAPK(1∶300)。

1.6Western印跡檢測(cè)Iba1、NF-κB、iNOS、p38MAPK和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)量 隨機(jī)選取各組大鼠5只，灌胃后分離中腦左、右側(cè)黑質(zhì)，置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)按照99∶1的比例加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液和苯甲基磺酰氟(PMSF)。充分勻漿后靜置10 min。4℃，12 000 r/min，離心20 min，吸取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)濃度。加入5× 上樣緩沖液，100℃沸水浴5 min，自然冷卻至室溫后放入-20℃保存。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)印至0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1.5 h。依蛋白分子質(zhì)量大小，將目的蛋白條帶分別移至Iba1(1∶800)、β-actin(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、iNOS(1∶1 000)、p38MAPK(1∶1 000)和p-p38MAPK(1∶1 000)一抗中，4℃過夜。室溫1 h，Tween-20 Tris磷酸鹽緩沖液(PBST)沖洗，置于辣根過氧化物酶(HRP)(1∶5 000)標(biāo)記的二抗，室溫1～2 h。PBST沖洗后，電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)，F(xiàn)luor Chem Q 蛋白印跡成像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 參照李曉健等〔6〕的方法，計(jì)數(shù)黑質(zhì)TH免疫陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定免疫陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(IOD)值，分析Western印跡結(jié)果。以損毀側(cè)黑質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/健側(cè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表示陽(yáng)性細(xì)胞的變化，以各目的蛋白/β-actin的比值來(lái)表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。應(yīng)用Prism5.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1NXS對(duì)PD大鼠行為的影響 與灌胃前旋轉(zhuǎn)行為〔模型組(4.30±0.67)r/min；NXS組(4.20±0.67)r/min〕比較，灌胃后模型組〔(4.00±0.71)r/min〕無(wú)明顯變化，而NXS組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)〔(1.60±0.42)r/min〕顯著降低(P<0.05)。對(duì)照組灌胃前、后無(wú)旋轉(zhuǎn)行為。

2.2NXS對(duì)PD大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的影響 對(duì)照組雙側(cè)黑質(zhì)和模型組正常側(cè)黑質(zhì)可見大量TH陽(yáng)性神經(jīng)元，胞體較大，呈褐色深染，突起明顯。計(jì)數(shù)對(duì)照組雙側(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之比為(1.02±0.04)。模型組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞較少，散在，胞體染色淺，突起短少；損毀側(cè)與正常側(cè)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)之比為(0.28±0.03)，較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)。NXS組損毀側(cè)黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與正常側(cè)細(xì)胞數(shù)之比為(0.70±0.04)，與模型組差異顯著(P<0.05，圖1)。

2.3NXS對(duì)PD大鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響 對(duì)照組雙側(cè)及模型組和NXS組正常側(cè)黑質(zhì)Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，胞體小，染色淺。模型組損毀側(cè)黑質(zhì)Iba1細(xì)胞胞體大，染色深，突起長(zhǎng)，呈激活狀態(tài)。NXS組Iba1陽(yáng)性細(xì)胞胞體變小，染色變淺(圖2)。模型組黑質(zhì)Iba1的IOD值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，NXS組表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05，表1)。模型組Iba1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，而NXS組表達(dá)量較模型組顯著降低(P<0.05，表1，圖3)。

圖1 TH在各組黑質(zhì)中表達(dá)(DAB,×100)

組別IODIba1NF-κBiNOSp38MAPK蛋白表達(dá)Iba1NF-κBiNOSp38MAPKp-p38MAPK對(duì)照組0.034±0.0100.033±0.0090.043±0.0030.051±0.0050.45±0.110.30±0.100.40±0.071.84±0.130.46±0.09模型組0.086±0.0111)0.086±0.0081)0.117±0.0121)0.131±0.0061)0.85±0.121)0.83±0.081)0.98±0.171)2.69±0.141)0.82±0.051)NXS組0.058±0.0062)0.056±0.0072)0.076±0.0082)0.093±0.0042)0.62±0.072)0.58±0.102)0.64±0.092)2.35±0.132)0.55±0.062)

與對(duì)照組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05

圖2 各組黑質(zhì)中膠質(zhì)細(xì)胞各蛋白表達(dá)(DAB,×400)

圖3 各組黑質(zhì)Iba1蛋白及β-actin表達(dá)

2.4NXS對(duì)PD大鼠黑質(zhì)iNOS、NF-κB、p38MAPK和p-p38MAPK表達(dá)的影響 對(duì)照組iNOS、NF-κB和p38MAPK陽(yáng)性細(xì)胞較少，染色較弱。模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著增多，染色明顯增強(qiáng)。NXS組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，染色反應(yīng)強(qiáng)度顯著減弱(圖2)。模型組黑質(zhì)iNOS、NF-κB和p38MAPK的IOD值明顯高于對(duì)照組，NXS組表達(dá)則顯著低于模型組(P<0.05)。對(duì)照組iNOS、NF-κB、p38MAPK和p-p38MAPK僅少量表達(dá)，模型組表達(dá)量較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，NXS組蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.05，圖4，表1)。

圖4 各組黑質(zhì)NF-κB、iNOS、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白及β-actin表達(dá)

3 討 論

神經(jīng)炎癥參與了PD的發(fā)生及發(fā)展過程，最終誘發(fā)DA能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡的重要性已成共識(shí)〔7〕。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)固有免疫細(xì)胞，在PD發(fā)病過程中介導(dǎo)的炎癥發(fā)揮了重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞激活后可誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS，iNOS是膠質(zhì)細(xì)胞活化增生的標(biāo)志物之一，iNOS能夠催化一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，后者可抑制細(xì)胞DNA合成，與小膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放的大量神經(jīng)炎癥因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等協(xié)同作用，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元凋亡或壞死〔8,9〕。Bournival等〔10〕發(fā)現(xiàn)，iNOS參與了1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元的損傷過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒素6-OHDA可誘導(dǎo)大鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，數(shù)量增多，iNOS表達(dá)水平明顯升高，PD大鼠中腦黑質(zhì)內(nèi)DA能神經(jīng)元顯著減少，并出現(xiàn)大鼠行為學(xué)異常。

p38MAPK信號(hào)通路是非常保守的三級(jí)磷酸化酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，參與調(diào)控機(jī)體許多生理活動(dòng)。大多數(shù)情況下，細(xì)胞外信號(hào)與受體特異性結(jié)合后通過MAPK激酶激酶作用于MAPK激酶(MKK)，使其磷酸化活化，而活化的MKK3/MKK6會(huì)作用于p38MAPK，使其磷酸化活化，即p-p38MAPK〔11〕。NF-κB是p38MAPK的重要下游信號(hào)因子，p-p38MAPK可誘導(dǎo)NF-κB活化，NF-κB可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA上啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)結(jié)合，參與調(diào)控下游相關(guān)基因(包括iNOS在內(nèi)的多種炎癥蛋白基因)表達(dá)〔9,12〕，共同誘導(dǎo)PD大鼠黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷〔13〕。

NXS的主要成分有黃芪、水蛭、大黃、石菖蒲、牛膝、川芎、牡丹皮等，可以減輕腦組織水腫，改善缺血、缺氧和減輕神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用〔14〕。黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分〔15〕，黃芪甲苷可以減輕由6-OHDA引起的DA能神經(jīng)元減少，并具有促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)等作用，提示黃芪甲苷具有聯(lián)合用藥治療PD的潛能〔16〕。水蛭中的水蛭素具有抗凝、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等功效〔17,18〕。紫杉醇水蛭素支架涂層復(fù)合物能明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎性活化過程中NF-κB p65的激活，顯著抑制下游炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)〔19〕。NXS能夠抑制PD大鼠黑質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少TNF-α和環(huán)氧酶(COX)-2表達(dá)〔4〕。

綜上，NXS可能是通過抑制p38MAPK信號(hào)通路和NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游調(diào)控的iNOS表達(dá)，最終減輕中腦黑質(zhì)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。