摘 要 用液體侵染法從黃海分離出一株能夠侵染聚球藻WH8102的噬藻體S-H35。電鏡檢測結(jié)果顯示，S-H35屬于短尾科噬藻體。噬藻體S-H35的一步生長曲線顯示其潛伏期約為4 h，爆發(fā)期約為8 h，裂解量為125。S-H35的基因組分析結(jié)果顯示，其基因組長度為175， 321 bp，共含有228個(gè)ORF，GC含量為41.51%?；蚬δ芊譃槭稍弩w的結(jié)構(gòu)、吸附相關(guān)、組裝、DNA復(fù)制及修復(fù)、末端酶、與宿主生理活動(dòng)相關(guān)的基因等。噬藻體S-H35與已知的噬藻體進(jìn)一步的基因比對結(jié)果并未顯示出明顯同源性。

關(guān)鍵詞 聚球藻 噬藻體 基因組

中圖分類號：X52 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

聚球藻（Synechococcus）是海洋藍(lán)細(xì)菌最主要的類群之一，也是超微型浮游生物中的優(yōu)勢組分，廣布于世界各大洋，它們在海洋中豐度極高，在熱帶和溫帶海洋中的豐度通常在103～105個(gè)/mL。聚球藻能量轉(zhuǎn)換迅速，在開放海域中的初級生產(chǎn)力可以達(dá)到總初級生產(chǎn)力的25%，是全球海洋中主要的初級生產(chǎn)者之一。此外，聚球藻是由2～4個(gè)單細(xì)胞組成的，具有結(jié)構(gòu)簡單、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)，因此一直是研究病毒感染的理想宿主。

噬藻體（Cyanophage）是一類能夠感染聚球藻、原綠球藻（Prochlorococcus）等藍(lán)細(xì)菌的病毒，其基因組大小介于30～60 kb之間，直徑一般在0.6～30 m之間。Safferman和Morris分離出第一株噬藻體“LPP”，它能夠同時(shí)感染鞘絲藻（Lynbya）、席藻（Phormidium）和織線藻（Plevtonema）三種宿主。隨后陸續(xù)有噬藻體純株被分離，到目前為止，共有幾百種不同的噬藻體被分離純化，而海洋聚球藻病毒的研究開始于1990年，之后很多聚球藻病毒被分離和研究。

新的海洋噬藻體的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步豐富了海洋噬藻體庫，并對進(jìn)一步研究宿主-噬藻體之間的相互作用關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在本研究中，為海洋噬藻體基因庫提供了新的基因組信息，并為維持海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定及防止藻類污染提供了新的線索。

1材料與方法

1.1材料

使用液體侵染法（原海水）分離噬藻體。

用于分離噬藻體S-H35的海水樣品是采自中國北黃海海域H35站位（32？0N，122？2‘E）表層海水，采水量為1L。將水樣經(jīng)0.22 m的濾膜過濾兩次，除去微微型生物及細(xì)菌，得到用于分離噬藻體的原海水；若病毒含量較低，用中型切向流將過濾后的海水濃縮100-1000倍，得到濃縮水樣，置于4℃黑暗條件下保存待用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1噬藻體的分離純化

將原海水與處于對數(shù)生長期的聚球藻按照體積比1：9的比例混勻，置于25癈，1000 lux光照條件的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1周左右可以觀察到裂解現(xiàn)象。用雙層平板法對噬藻體進(jìn)行純化，重復(fù)3次純化實(shí)驗(yàn)，得到純凈噬藻體。

1.2.2噬藻體基因組的提取

液體侵染法富集病毒，用PEG濃縮法濃縮純化病毒，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究（PEG濃縮病毒的方法參照Colombet等并加以改良）。

噬藻體基因組的提取方法具體參照Verheust等并加以改良。

1.2.3噬藻體的電鏡觀察

測定噬藻體的效價(jià)，當(dāng)效價(jià)大于1010PFU/ml時(shí)，用移液器量取20 L的噬藻體樣品加到銅網(wǎng)上，置于室溫下15 min，加一滴2%的磷鎢酸，染色10 min用于電鏡觀察。

1.2.4噬藻體的一步生長曲線

（1）將噬藻體與其宿主按照0.01的比例混合均勻。

（2）將加入噬藻體的聚球藻置于25℃，1000 lux持續(xù)光照的環(huán)境中培養(yǎng)，加入后即開始計(jì)時(shí)。

（3）在0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時(shí)分別取樣，并用25%的戊二醛進(jìn)行固定。每個(gè)樣品都設(shè)置三個(gè)平行樣，分別測定后采用平均值。

（4）用流式細(xì)胞儀測定噬藻體的具體數(shù)值，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，以感染體系中的噬藻體不同時(shí)間的濃度為縱坐標(biāo)，繪制噬藻體的生長曲線，通過計(jì)算得出噬藻體的潛伏期、裂解期和裂解量。

1.2.5噬藻體的宿主專一性鑒定

用JYS Red、TB、RCC2673、RCC753、RCC556、RCC2535、RCC307、TE4、CCMP1333、SW、WH8109、TB3 winter、TB2 winter、TB1 winter、KSHK01C、Prasce syn、YOKATA BAY、b3、WH7803、WH8102、MW01、MW02、MW03、LTW Red1、LTW Red2、MW15、SC7、b23、LTW Green 、PSHK05、KSHK03、PSHK01、KSHK05共33株聚球藻進(jìn)行宿主專一性鑒定。

1.2.6噬藻體的基因組測序

對濃縮純化后的噬藻體高通量測序得到原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads），對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，得到的Clean Data用于后續(xù)分析。采用雙端測序的方法，對基因組樣品進(jìn)行污染檢測后進(jìn)行基因組拼接，采用SPAdes軟件進(jìn)行序列拼接，得到原始Scaffold?；蚪M注釋使用進(jìn)行編碼基因的預(yù)測，所采用的軟件是GeneMarkS（http：//topaz.gatech.edu/）。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1噬藻斑的觀察

用雙層平板法培養(yǎng)噬藻體S-H35，置于25℃，1000 lux的恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周左右，即可觀察到直徑1 mm的半透明的噬藻斑，10天左右，噬藻斑的直徑可以擴(kuò)大到1～2 cm。

2.2透射電鏡觀察

S-H35尾部很短幾乎不可見，因此推測屬于短尾病毒科，頭部直徑約為40 nm（圖1）。

2.3 S-H35的一步生長曲線

如圖2所示，噬藻體S-H35的潛伏期約為4 h，爆發(fā)期約為8 h，裂解量為125。

2.4 S-H35的宿主專一性鑒定

侵染結(jié)果顯示，S-H35除了能侵染聚球藻WH8102外，還能侵染聚球藻WH7803、LTW Red1和MW01，因此推測，噬藻體S-H35不具有種屬特異性。

2.5 S-H35的基因組分析

噬藻體S-H35的基因組長度為175321 bp，共含有228個(gè)ORF，基因的平均長度為649 bp，基因總長度占基因組總長度的比為84.4%，GC含量為41.3%，tRNA個(gè)數(shù)為8個(gè)，rRNA為1個(gè)。

對其ORF進(jìn)行預(yù)測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為228個(gè)，其中有21個(gè)（9.2%）是檢索不到假定功能（putative function）的，在所有的ORF中，有74個(gè)（32.4%）能夠檢索到功能注釋的結(jié)果，有133（58.3%）個(gè)ORF未能推測其功能。

S-H35的基因組中，基因的功能，大概可分為以下幾類：噬藻體自身結(jié)構(gòu)組成；DNA復(fù)制與修復(fù)、包裝；末端酶；以及對宿主藻的生理活動(dòng)起輔助作用的基因。

為了研究噬藻體S-H35的系統(tǒng)發(fā)生分析，利用蛋白軟件和系統(tǒng)分析軟件Mega6.06進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。由于S-H35屬于短尾噬藻體，故選用短尾噬藻體的高度保守序列—DNA聚合酶基因所編碼的蛋白序列與選定的噬藻體的序列用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖3中可以看出，S-H35與Synechococcus phage ACG-2014c及Synechococcus phage syn9在進(jìn)化上的關(guān)系更近。

3討論

噬藻體的基因組比對分析結(jié)果顯示，噬藻體S-H35跟其它噬藻體并未有顯著相似性。這證明S-H35是從海水中分離得到的新噬藻體，S-H35的基因組序列信息對于以后噬藻體的分子生物學(xué)研究能夠提供有用的基礎(chǔ)信息。一步生長曲線顯示，噬藻體的S-H35的裂解期較長，裂解量較大。

S-H35基因組中的基因大部分功能未知，但是從同源比對中可以發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)（ORF88、ORF162、ORF181）與轉(zhuǎn)錄有關(guān)；2個(gè)（ORF23、ORF162）很可能與RNA的組裝有關(guān)； 8個(gè)（ORF24、ORF39、ORF87、ORF129、ORF144、ORF148、ORF171、ORF185）可能與DNA復(fù)制和修復(fù)有關(guān)，ORF24編碼DNA解旋酶，ORF39編碼DNA甲基化酶，ORF85編碼單鏈DNA結(jié)合蛋白；10個(gè)（ORF6、ORF52、ORF81、ORF133、ORF173、ORF191、ORF220、ORF221、ORF222、ORF228）與病毒包膜及結(jié)構(gòu)有關(guān)；ORF228與病毒侵染循環(huán)有關(guān)；ORF148編碼的是短尾科病毒的保守序列DNA聚合酶，能夠保證噬藻體的基因組準(zhǔn)確、迅速的復(fù)制以及產(chǎn)生更多的裂解后代。ORF143編碼MazG基因，具有高度的保守序列；除去與自身繁殖功能有關(guān)的ORF，S-H35基因組中也存在對宿主細(xì)胞有著重要功能的基因，如ORF107可以編碼光系ⅡD1蛋白，可以在宿主光系統(tǒng)受到強(qiáng)光損傷時(shí)，維持宿主的正常光合作用，滿足其對能量的需要。電泳檢測結(jié)果表明其為dsDNA，尾部很短幾乎不可見，因此推測屬于短尾病毒科。

核酸序列Accession Number：KY945241。

作者簡介：徐霞霞，1991年1月，女，山東省煙臺市人，中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院2014級微生物學(xué)碩士，研究方向：海洋噬藻體。

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