單鴛露 王良榮 葉玉柱 胡正楊

機械通氣被廣泛應(yīng)用于臨床，用于重癥患者和手術(shù)患者的生命支持，但機械通氣也會誘發(fā)加重肺損傷，即機械通氣肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）。研究表明，不合理的機械通氣尤其是大潮氣量機械通氣引起肺泡過度膨脹，造成肺組織氣壓傷和容積傷，破壞肺屏障功能，最終致炎癥介質(zhì)的釋放引起生物傷[1-2]。人參皂甙Rb1是人參中有效單體成分之一，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[3]。本研究建立大鼠VILI模型，擬觀察人參皂甙Rb1對大潮氣量機械通氣大鼠肺組織炎癥和相關(guān)通路蛋白的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 SPF級成年雄性SD大鼠30只，體重300～350g[溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2010-0150]，動物實驗前禁食12h，自由飲水。采用隨機數(shù)字法分為假手術(shù)組（C組）、VILI組和人參皂甙Rb1預(yù)處理組（Rb1組），每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 人參皂甙Rb1（上海源葉生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO試劑盒（南京建成生物工程研究所）。Trizol提取液（美國Life technologies公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（美國Fermentas Life Science公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗IgG，細胞質(zhì)內(nèi)參GAPDH（英國Abcam公司）；HX-300小動物呼吸機（成都泰盟有限公司）；酶標儀（美國Thermo公司）；垂直電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 VILI模型的建立 3組大鼠予腹腔注射20%烏拉坦8ml/kg麻醉，暴露左股靜脈并置管用于輸液和給藥，暴露氣管，切開氣管。VILI組及Rb1組大鼠靜脈注射維庫溴銨（浙江仙居藥業(yè)）6mg/kg阻斷自主呼吸，并予氣管內(nèi)插入自制氣管導(dǎo)管，接HX-300小動物呼吸機進行機械通氣4h，建立VILI模型。通氣參數(shù)設(shè)定：潮氣量40ml/kg，呼吸頻率60次/min，吸呼比2∶3。Rb1組于機械通氣前30min靜脈注射人參皂甙Rb1 40mg/kg，C組和VILI組給予等容量0.9%氯化鈉溶液。C組氣管切開后保留自主呼吸，未予機械通氣。

1.4 標本采集及指標檢測 4h后3組大鼠予頸動脈放血處死，迅速取出心臟和肺，結(jié)扎右肺門，4℃0.9%氯化鈉溶液左肺支氣管肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗液（BALF）5ml，并在 4℃下以 2 000r/min 離心10min，取上清液-70℃凍存待測，采用ELISA法測定BALF中TNF-α、IL-6水平，硝酸鹽還原酶法檢測NO水平。

1.5 肺組織濕/干重比（W/D）測定 取右肺上葉，用濾紙吸干肺組織表面水分稱重后為濕重（W），置于70℃恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱72h至恒重再稱重為干重（D），計算肺組織W/D，以反映肺水腫程度。

1.6 肺組織病理變化 右肺中葉于10%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，主要觀察有無肺水腫、肺泡與肺間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血，肺泡隔增厚程度及透明膜的形成。

1.7 肺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOs）mRNA的檢測剩余左肺組織取50mg置于研缽加液氮研磨，用Trizol萃取總RNA，進行RT-PCR對擴增產(chǎn)物進行半定量分析，iNOs引物序列正鏈 5′-TAG AGG AAC ATC TGG CCA GG-3′反鏈 5′-TGG CCG ACC TGA TGT TGC CA-3′擴增產(chǎn)物大小為255bp，內(nèi)參GAPDH引物序列正鏈5′AAC CCA TCA CCA TAT TCC AGG AGC-3′，反鏈 5′CAC AGT CTT CTG AGT GGC AGT GAT-3′，擴增產(chǎn)物大小350bp。RT-PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性95℃，5min；變性 95℃，30s；退火 57℃，30s；延伸 72℃ 30s；循環(huán)33次，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行分析，以目的基因擴增產(chǎn)物灰度值與內(nèi)參GAPDH擴增產(chǎn)物灰度值的比值來表示基因表達水平。

1.8 肺組織NF-κB的測定 采用Western blot檢測。依照試劑盒說明書提取胞核蛋白，采用BCA法測定濃度。蛋白在10%SDS-PAGE中室溫電泳分離，300mA、70min濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加一抗 NF-κB（稀釋度 1∶2000）抗體和 GAPDH（稀釋度1∶500）抗體，4℃孵育過夜，加入生物素標記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光法進行檢測，膠片掃描拍攝圖像并進行半定量分析，采用Image J測定目的條帶的吸光度值，并以目的蛋白和相應(yīng)內(nèi)參的吸光度值比值表示目的條帶相對強度。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用表示，組間比較采用單向方差分析，方差齊性者兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnet′t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13 組大鼠肺BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺組織W/D的比較 與C組相比，VILI組和Rb1組BLAF中 TNF-α、IL-6、NO 水平均升高（均P＜0.05）；與 VILI組比較，Rb1組TNF-α、IL-6、NO水平均下降（均P＜0.05）。與C組比較，VILI組和Rb1組肺組織W/D比值升高（P＜0.05）；與VILI組比較，Rb1組肺組織W/D比值降低（P＜0.05）。見表 1。

表1 3組大鼠BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺組織W/D的比較

2.2 3組大鼠肺組織光鏡下顯微結(jié)構(gòu)改變 光鏡下C組無明顯肺損傷，肺部無水腫，肺泡隔均一、結(jié)構(gòu)清晰（圖1a，見插頁），VILI組可見明顯的肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)滲出水腫，肺間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，肺泡隔增寬，局灶的肺泡塌陷和肺不張，部分出現(xiàn)肺大泡（圖1b，見插頁）；Rb1肺組織損傷程度較VILI組緩解，肺泡隔輕度增寬，炎性細胞浸潤程度較VILI組明顯減輕（圖1c，見插頁）。

圖1 3組大鼠肺組織光鏡顯微結(jié)構(gòu)變化（a：C 組；b：VILI組；c：Rb1組；HE 染色，×200）

2.3 3組大鼠肺組織iNOs mRNA表達情況 與C組相比，VILI組和Rb1組肺組織iNOs mRNA表達增高（P＜0.05）；與VILI組比較，Rb1組肺組織iNOs mRNA表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠肺組織iNOs mRNA表達（與C組比較，*P＜0.05；與 VILI組比較，△P＜0.05）

2.4 3組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達情況 與C組相比，VILI組和Rb1組肺組織NF-κB蛋白表達增加，與VILI組比較，Rb1組肺組織NF-κB蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 3組大鼠肺組織NF-κB蛋白表達（與C組比較，*P＜0.05；與 VILI組比較，△P＜0.05）

3 討論

本次研究參照前期研究采用40ml/kg大潮氣量機械通氣4h建立大鼠VILI模型[4]，肺泡毛細血管通透性增加，炎性細胞浸潤，肺組織含水量顯著增加，證實VILI模型制備成功。而人參皂甙Rb1處理后機械通氣大鼠肺組織病理損傷明顯緩解，炎癥因子釋放減少，肺部微循環(huán)通透性損傷和肺水腫減輕。

研究表明，機械刺激（牽拉、剪切力）作用肺組織造成機械損傷，通過各種信號傳導(dǎo)途徑，觸發(fā)促炎細胞因子釋放和中性粒細胞的募集，形成瀑布級聯(lián)效應(yīng)，導(dǎo)致肺部炎癥甚至全身炎癥反應(yīng)，即“生物傷”[5]。NF-κB作為炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，在氧化應(yīng)激、細胞因子，脂多糖等多種刺激下，NF-κB的激活和IkB-α的磷酸化，促使NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，調(diào)控多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄，炎癥因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）、細胞黏附分子等表達增加，同時進一步刺激NF-κB的活化[6]。既往研究表明NF-κB信號通路的激活在VILI的發(fā)病中起重要作用[7-8]，Held等[9]研究通過離體肺傷害性機械通氣證實過度通氣可刺激細胞因子和趨化因子產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB活化。本研究也證明VILI大鼠肺組織 NF-κB活性較對照組明顯增加，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6表達也顯著增加，表明機械通氣過程中NF-κB活化可能參與機械通氣后肺組織中致炎細胞因子合成釋放的調(diào)控過程。人參皂甙Rb1具有抗炎、抗細胞凋亡等藥理作用。研究證明，Rb1通過抑制NF-κB的活性，改善腸缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷[10]。同樣研究證實，人參皂甙Rb1通過使炎癥反應(yīng)活性減弱和抑制NF-κB易位可顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)Rb1預(yù)處理后，VILI大鼠的NF-κB活性降低，提示人參皂甙Rb1可能通過降低NF-κB活性，降低炎癥因子的表達，減輕VILI。

NO作為一種重要的炎癥介質(zhì)，參與多種疾病發(fā)病過程[哮喘，急性肺損傷（ALI）和循環(huán)休克]，主要由一氧化氮合酶（NOs）催化產(chǎn)生。在病理狀態(tài)下，由iNO催化產(chǎn)生大量的NO，不僅直接損傷組織細胞，還易產(chǎn)生氧自由基，并生成過氧亞硝酸陰離子（ONOO-），導(dǎo)致硝化應(yīng)激和組織損傷。Peng等[12]研究發(fā)現(xiàn)小鼠大潮氣量機械通氣后iNOs表達顯著增加，iNOs的表達改變及硝化應(yīng)激的激活與肺毛細血管通透性增加相關(guān)，同時在iNOs基因敲除小鼠機械通氣中，肺損傷加重，硝化應(yīng)激和肺毛細血管通透性顯著增加，更證明了iNOs在VILI中的直接作用。本研究結(jié)果表明大潮氣量長時間通氣后，大鼠肺組織iNOs轉(zhuǎn)錄活躍，NO表達增加，與上述研究結(jié)果一致。人參皂甙Rb1干預(yù)后，大鼠iNOs表達顯著降低。有研究表明NF-κB的激活不僅可增加趨化因子和細胞因子，同樣可增加iNOs的表達[13]。由此推斷，在機械通氣肺損傷大鼠，人參皂甙Rb1也可能通過降低NF-κB的活性，減少iNOs的表達，抑制促炎因子的釋放。

綜上所述，人參皂甙Rb1可降低NF-κB和iNOs的活性，減少炎性介質(zhì)釋放，減輕機械通氣誘導(dǎo)肺損傷。