吳炳男，陳 麗，張云龍，陳 婷，陸昌瑞

（東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201600）

PPR蛋白（pentatricopeptide repeat protein）是由多個以35個氨基酸組成的PPR模體為重復單位串聯(lián)排列組成的一類蛋白質[1]，是迄今為止發(fā)現的陸生植物中最大的蛋白質家族之一[2-5]，參與RNA的剪接、編輯、穩(wěn)定和翻譯等重要生理過程[6]。DYW亞族是PPR蛋白家族中具有RNA編輯功能的一類蛋白質，從結構上可分為N端PPR串聯(lián)模體和C端E、E+及DYW結構域[7-10]。N端PPR串聯(lián)模體中每兩個PPR模體反向平行形成螺旋-轉角-螺旋結構，多個螺旋-轉角-螺旋結構串聯(lián)排列形成一個凹腔，可與RNA堿基結合，具有識別底物RNA功能[11-15]。C端的DYW結構域因其尾端具有保守的D-Y-W三肽而得名[1]，與RNA編輯過程中胞苷脫氨作用（C-U）有關，在其一級序列中包含HXE、CXXCH兩個典型的鋅指結構序列[16]。在現有文獻報道中，DYW結構域十分不穩(wěn)定，且溶解度很低。所以通過基因重組方式體外獲得大量、穩(wěn)定的DYW結構域蛋白片段存在很大難度[17]。

Zn2+通過與鋅指結構位點氨基酸結合從而穩(wěn)定蛋白質的結構，當去除鋅指結構的Zn2+后，結構變得松散；而重新加入Zn2+之后，鋅指結構又可逐漸恢復并穩(wěn)定[18]。因此，在一些體外重組蛋白表達中，通過添加Zn2+可提高相應蛋白質的穩(wěn)定性，進而提高蛋白質的產量[19]。本實驗以DYW族PPR蛋白OTP82的鋅指結構域作為研究對象，利用ppSUMO原核表達系統(tǒng)制備該蛋白，通過在培養(yǎng)過程中添加Zn2+，提高了外源表達蛋白的穩(wěn)定性，并對Zn2+的作用機制進行了初步探索，驗證了Zn2+可在蛋白表達時直接作用于鋅指結構位點，幫助蛋白表達和折疊，并維持鋅指結構的穩(wěn)定。

1 儀器及材料

1.1 儀器

JN-02C低溫超高壓連續(xù)流細胞破碎儀（JNBIO）；BIO-DL移液槍（Therom Fisher）；5810 R低溫道速離心機（Eppendorf）；Gen Pure UF超純水機（Therom Fisher）；Bio Mate 3S分光光度計（Therom Fisher）；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽（Bio-Rad）；Mini-Sub cell GT水平電泳儀（Bio-Rad）；Trans-Blot SD 半干轉印槽（Bio-Rad）；Chemi DocTM XRS + Image LabTMsoftware（Bio-Rad）。

1.2 材料

菌株E.coliRosetta（DE3）、DH5α，ppSUMO表達載體，基因（otp82-dyw）均為本實驗室自有保存；培養(yǎng)基，限制性內切酶，T4 DNA連接酶，Pfu DNA擴增聚合酶，質粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，Ni-TED親和純化介質，PCR產物純化試劑盒，卡那霉素，氯霉素，異丙基硫代半乳糖苷（ITPG）等[生工生物工程（上海）]。水為超純水。

1.3 引物

引物名稱及序列見表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物名稱及序列

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 抗生素及誘導劑儲存液的配制 取卡那霉素2 g，加入超純水溶解后定容至40 ml。過濾除菌后得到濃度為50 mg/ml的抗生素儲存液；相同方法配制25 mg/ml氯霉素儲存液；1 mol/L誘導劑IPTG儲存液。

2.1.2 親和純化緩沖液的配制 Buffer A（重懸液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L 二硫蘇糖醇（DTT）儲存液1 ml，甘油50 ml，混合后加入超純水至800 ml后，調pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer B（平衡液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液20 ml，混合后加入超純水至800 ml，調pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer W（漂洗液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液50 ml，混合后加入超純水至800 ml，調pH至8.0，超純水定容至1 L。Buffer E（洗脫液）：取1 mol/L Tris-HCl儲存液（pH 8.0）20 ml，1 mol/L NaCl儲存液200 ml，1 mol/L DTT 儲存液1 ml，甘油50 ml，1 mol/L咪唑儲存液250 ml，混合后加入超純水至800 ml，調pH至8.0，超純水定容至1 L。

2.2 克隆構建、定點突變與菌株保存

2.2.1 表達質粒的構建 取模板基因（otp82-dyw）質粒1 μl，加入濃度為10 μmol/ml的上下游引物Primer F、Primer R各1 μl，然后加入5 μl 10×PCR Buffer及1 μl dNTP和1 μl Pfu酶，用水補齊至50 μl，進行PCR反應（95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最終延伸10 min）。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，并用PCR產物純化試劑盒純化PCR產物。利用限制性內切酶BamH I、Xho I酶切PCR產物及ppSUMO載體（37 ℃，3 h），并采用膠回收試劑盒回收酶切產物。使用T4 DNA連接酶將酶切后的載體與插入片段連接起來（16 ℃，過夜），并轉化DH5α感受態(tài)細胞，在含卡那霉素的抗性平板上過夜培養(yǎng)。挑取平板上的單克隆菌落，提取質粒并測序鑒定。

2.2.2 定點突變 取野生型基因序列（otp82-dyw）為模板，將突變引物Primer-M1F與下游引物Primer R各1 μl加入PCR反應體系中進行PCR反應（95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最終延伸10 min）。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，得到突變株M1基因片段。將突變引物（Primer-M2F、Primer R或Primer F、Primer-M1R）各1 μl加入PCR反應體系中進行PCR反應，條件同上。然后將得到的兩組產物等比例混合后，取2 μl作為模板，利用引物Primer F/R各1 μl進行PCR反應，得到突變株M2基因片段。然后利用相同方法構建表達克隆，并進行測序。

2.2.3 轉化及菌種保存 將測序正確的表達質粒轉化入Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，經涂板37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落37 ℃過夜培養(yǎng)，得到表達單克隆菌株。將培養(yǎng)好的菌液加入等體積80%甘油后，-80 ℃保存。

2.3 外源蛋白的誘導表達與純化

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進行培養(yǎng)。OD600=0.6時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。5000 r/min離心收集菌體，加入Buffer A重懸（重懸菌液濃度為10%）。將菌體重懸液高壓勻漿破碎3次，條件為4 ℃，1300 MPa。細胞勻漿液20 000 r/min速離心，收集上清。采用Ni-TED進行目標蛋白的親和純化。首先，重力柱中的親和純化介質用5倍柱體積的Buffer B平衡。后加入上清，使上清流經親和介質2次。之后用30倍柱體積的Buffer W漂洗。最后用5倍柱體積的Buffer E洗脫目標蛋白。各個步驟留取蛋白樣品進行Bradford法濃度檢測及SDS-PAGE、Western-Blot檢測。

2.4 快速誘導表達

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達克隆菌株菌液按1:100的比例接入LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進行培養(yǎng)。當OD600=0.6時取1 ml培養(yǎng)液留樣。之后加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，37 ℃，225 r/min誘導3 h。取1 ml培養(yǎng)液留樣進行SDS-PAGE檢測。

2.5 表達菌株加Zn2+培養(yǎng)

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進行培養(yǎng)。當OD600=0.6時加入IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，并加入ZnCl2溶液至終濃度分別為0，0.125，0.25，0.375，0.5，1 mmol/L。16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。5000 r/min離心收集菌體備用。

2.6 親和純化

將同一份含Zn2+的上清分成3等份，并在其中加入EDTA使其終濃度分別為0，10，20 mmol/L。將含不同濃度EDTA的上清分別用1 ml Ni-TED（EDTA耐受型）親和純化介質進行純化，并對蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測。

2.7 Zn2+作用時間探索

分別在培養(yǎng)、誘導及細胞破碎時添加Zn2+至終濃度為1 mol/L。高壓破碎細胞后，14 000 r/min、4 ℃離心1 h。取上清留取樣品進行SDS-PAGE檢測。

2.8 不同二價離子作用對比

將37 ℃過夜培養(yǎng)的表達克隆菌株菌液按1:100的比例接入卡那霉素及氯霉素雙抗性LB培養(yǎng)基中，37 ℃，225 r/min進行培養(yǎng)。OD600=0.6時加入IPTG溶液至終濃度為0.1 mmol/L，并分別加入ZnCl2、MnCl2及NiSO4溶液至終濃度為1 mmol/L。16 ℃，225 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。取全細胞留樣，進行SDS-PAGE及Western-Blot檢測。

3 結果

3.1 不同濃度Zn2+對鋅指結構蛋白穩(wěn)定性的影響

通過分子克隆技術構建蛋白表達質粒ppSUMOOTP82-DYW質粒（ppSUMO-OD）。經誘導表達得到目的蛋白His-SUMO-OTP82-DYW（HSOD）。其理論相對分子質量（Mr）為21.8×103，目的蛋白示意圖見圖1 A，蛋白中含保守的鋅指結構位點HXE、CXXCH，并在目的蛋白N端添加His-SUMO融合標簽，用于目的蛋白的表達及純化。

誘導表達實驗結果見圖1 B、C。不添加Zn2+時，全細胞樣品中目的蛋白降解嚴重。添加Zn2+后，目的蛋白降解情況被抑制，目的蛋白穩(wěn)定性隨Zn2+濃度的提高而提高。當Zn2+濃度達到1 mmol/L時，目的蛋白最為穩(wěn)定。Zn2+濃度超過1 mmol/L后，表達菌株生長受到明顯抑制，Zn2+濃度超過1.5 mmol/L后，表達菌株生長停滯。圖1 D、E表明Zn2+同樣可增加上清中可溶性目的蛋白的穩(wěn)定性。綜上，Zn2+可有效提高鋅指結構蛋白的穩(wěn)定性。

圖1 Zn2+對鋅指結構蛋白穩(wěn)定性的影響

3.2 Zn2+對目的蛋白親和純化效果的影響

通過添加Zn2+，目的蛋白的穩(wěn)定性得到了明顯提升。然而高濃度的Zn2+會影響組氨酸標簽（6×His）與親和介質的親和能力，使柱結合效率降低，需添加金屬離子螯合劑EDTA去除過量的Zn2+，從而提高柱結合效率。結果見圖2。由圖2可見，不添加EDTA的洗脫液樣品中沒有出現目標蛋白條帶，證明目的蛋白在高濃度的Zn2+存在時難以與親和介質結合；添加EDTA后，目標蛋白與親和介質的結合效率明顯提高，洗脫液樣品中出現明顯目的蛋白條帶，且EDTA濃度為10 mmol/L時結合效果及純化效果最佳；EDTA濃度達到20 mmol/L 時，因過量EDTA的競爭性抑制作用，導致目的蛋白與Ni2+的結合能力降低。因此，上清中添加10 mmol/L的EDTA可有效地增加目的蛋白的親和純化效率。

圖2 Zn2+對目的蛋白親和純化效果的影響

3.3 最優(yōu)條件下融合蛋白親和純化效果

根據上述實驗結論，確定誘導表達時Zn2+添加濃度為1.0 mmol/L；親和純化時上清液中EDTA添加濃度為10 mmol/L。在此條件下，進行了融合蛋白HSOD誘導表達及親和純化實驗。實驗結果表明，融合蛋白的降解情況得到了明顯抑制。蛋白純度及純化效率也有了明顯提高（見圖3）。利用考馬斯亮藍染色后進行灰度分析，得蛋白純度約63%。經計算得到目標蛋白得率為每升菌液7.96 mg。

圖3 最優(yōu)條件下目的蛋白的親和純化效果

3.4 Zn2+穩(wěn)定鋅指結構蛋白的機制初探

發(fā)現Zn2+可明顯提高OTP82蛋白DYW鋅指結構域的穩(wěn)定性之后，對Zn2+添加時間、Zn2+作用位點及Zn2+作用的特異性進行了初步探索。

3.4.1 Zn2+作用于蛋白表達過程 Zn2+作用時間點的探索實驗結果見圖4，在全細胞樣品中，相比于不添加Zn2+的樣品，培養(yǎng)及誘導時添加Zn2+均可顯著提高目的蛋白穩(wěn)定性；而在上清樣品中，破碎時添加Zn2+后，目的蛋白的降解情況并未得到改善。實驗結果證明Zn2+在鋅指結構蛋白表達時幫助蛋白表達，并穩(wěn)定其結構。

圖4 Zn2+作用時間點實驗結果

圖5 不同二價離子對鋅指結構蛋白穩(wěn)定性的影響

3.4.2 不同二價離子對鋅指結構蛋白穩(wěn)定性的影響Zn2+，Mn2+及Ni2+作用結果見圖5。雖然Zn2+、Mn2+及Ni2+同為過渡金屬的二價離子，但添加Mn2+、Ni2+均無法穩(wěn)定目的蛋白，僅Zn2+可有效提高鋅指結構蛋白穩(wěn)定性。

3.4.3 Zn2+作用位點的探索 對兩個保守鋅指位點進行丙氨酸突變得到突變株M1（HXE→AXA）、M2（CXXCH→AXXAA），見圖6A。誘導表達結果見圖6 B、C。全細胞樣品中，由于突變株破壞了部分鋅指結構，Zn2+對蛋白質的穩(wěn)定性影響要明顯弱于野生型菌株。因此，Zn2+只可有效地穩(wěn)定鋅指結構完整的蛋白質。綜上所述，Zn2+作用于鋅指結構。

圖6 Zn2+作用位點的探索

4 討論

鋅指蛋白作為生物界中最重要的功能性蛋白之一，一直是科學界的研究熱點。如何對其進行大量、穩(wěn)定的體外表達純化也成為鋅指蛋白的結構及功能研究的前提。本文以OTP82蛋白中的保守鋅指結構域為研究對象，證明Zn2+在鋅指結構蛋白的體外表達過程中扮演重要角色。這為其他鋅指結構蛋白的體外表達提供了重要參考及依據。

研究中通過添加適量的EDTA，消除過量Zn2+對組氨酸標簽親和純化效率的負面影響。這也為其他鋅指結構蛋白的組氨酸標簽親和純化或其他需添加金屬離子的蛋白質組氨酸標簽親和純化過程的優(yōu)化提供新的思路。

Zn2+的作用機制實驗結果表明，Zn2+濃度及鋅指結構的完整性都直接影響鋅指蛋白的穩(wěn)定性。這也說明在鋅指蛋白的表達及純化體系中，需添加適量的Zn2+以保持蛋白的穩(wěn)定。同時，也提示Zn2+在鋅指蛋白行使功能方面具有重要作用。

鋅指蛋白是真核生物中最豐富的轉錄因子之一，在基因的表達調控、細胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作用。而鋅指蛋白的結構及功能研究又依賴于體外高效、穩(wěn)定的表達、純化。因此，本文實驗結果對于鋅指蛋白的結構及功能方面的研究有重要的借鑒意義。

5 結論

本文實驗結果表明，在蛋白原核表達體系中添加Zn2+可有效提高OTP82蛋白鋅指結構域的穩(wěn)定性。親和純化條件優(yōu)化實驗結果證實，細胞上清中添加10 mmol/L EDTA可有效提高融合蛋白HSOD的組氨酸標簽與親和介質的結合效率。Zn2+對鋅指結構蛋白穩(wěn)定性影響機制探究結果顯示，Zn2+作用于鋅指結構蛋白的表達過程，并穩(wěn)定其高級結構。與Mn2+等二價離子的對比實驗證實，只有Zn2+可有效提高鋅指結構蛋白的穩(wěn)定性。蛋白中保守的鋅指結構位點突變后，Zn2+無法顯著提升鋅指蛋白的穩(wěn)定性，表明Zn2+通過鋅指結構位點提高鋅指結構的穩(wěn)定性。