白秀萍，董玉杰

（1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086；2.山東金城生物藥業(yè)有限公司，山東 淄博 255000）

氫化可的松為腎上腺皮質(zhì)激素類的典型代表藥物，可調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成及代謝，具有抗炎、抗毒、抗休克及抗過(guò)敏等藥理作用，既可作為糖皮質(zhì)激素使用，也可作為制備其它甾體激素藥物的起始化合物[1]。目前國(guó)內(nèi)氫化可的松的制備均采用半合成方法，工藝中使用甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷等有機(jī)溶劑，限值見表1。為保證產(chǎn)品安全，本文依據(jù)中國(guó)藥典2015年版四部及相關(guān)文獻(xiàn)[2-3]建立了測(cè)定殘留溶劑甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷殘留量的氣相色譜法。

表1 氫化可的松殘留溶劑限度表

1 儀器與試藥

6890N 氣相色譜儀（配FID檢測(cè)器，Agilent G1888 頂空進(jìn)樣器，20 ml頂空瓶，美國(guó)Agilent）；氫化可的松（批號(hào)：0905034，0905035，0905045，0905046，山東新華）；甲醇（分析純，天津四友），氯仿（分析純，國(guó)藥集團(tuán)），1,2-二氯乙烷（分析純，萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠），二甲基亞砜（分析純，天津福晨）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備

2.1.1 空白溶液制備 精密量取二甲基亞砜1.0 ml置入20 ml頂空瓶，密封，待用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液制備 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A：精密稱取無(wú)水甲醇0.2 g（約0.25 ml）、氯仿10 mg（約7 μl）、1,2-二氯乙烷10 mg（約7 μl）置入已加入少量二甲基亞砜的100 ml量瓶溶解，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻得A液。

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B：取5.0 ml標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A，用二甲基亞砜稀釋至100 ml，混合均勻。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液B 1.0 ml置入20 ml頂空瓶，密封，混合均勻，同法配制6份。

2.1.4 樣品溶液的制備 精密稱取樣品約0.1 g置入20 ml頂空瓶，加入1.0 ml二甲基亞砜溶解，密封。每批樣品制備2份。

2.1.5 樣品空白溶液制備 取樣品（批號(hào)：0905034），研細(xì)，充分干燥，將其中殘留溶劑降至較低的水平，作為樣品空白。稱取樣品空白約0.10 g，精密稱定，置入20 ml頂空瓶，精密加入二甲基亞砜1.0 ml溶解，密封，混合均勻。

2.2 儀器條件

毛細(xì)管色譜柱DB-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；柱溫：初始溫度40 ℃，保溫10 min，以60 ℃/min升至200 ℃保持3 min；進(jìn)樣口溫度：140 ℃；檢測(cè)器溫度：250 ℃；載氣：N2；載氣流速：5 ml/min；分流進(jìn)樣，分流比（1:1）；平衡溫度：120 ℃；平衡時(shí)間：30 min；針溫：130 ℃；Transfer line 溫度：140 ℃；加壓時(shí)間：0.5 min；進(jìn)樣體積：1.0 ml。

2.3 計(jì)算方法

將空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，依次置入頂空進(jìn)樣器，120 ℃下平衡30 min。取空白溶液進(jìn)樣，記錄圖譜，在標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液中扣除溶劑峰。取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣。溶劑出峰順序依次為甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷。相鄰組分之間的分離度R，應(yīng)不小于1.5；取6份標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣，以3種溶劑峰面積計(jì)算的RSD，均應(yīng)不大于15.0%。取每個(gè)供試溶液進(jìn)樣，各進(jìn)樣1次，記錄圖譜。計(jì)算公式如下。

注：X：殘留甲醇、 氯仿、1,2-二氯乙烷的量（ppm）；Ai：供試溶液的圖譜中溶劑(i)的峰面積；A0：空白溶液的圖譜中相應(yīng)溶劑(i)的峰面積；Asi：標(biāo)準(zhǔn)溶液的圖譜中溶劑(i)的峰面積；W：樣品的稱量（g）；Wsi：每個(gè)溶劑的稱重（g）。

2.4 專屬性試驗(yàn)

取空白溶液進(jìn)樣，分析溶劑（二甲基亞砜）對(duì)檢測(cè)的影響；取樣品空白溶液進(jìn)樣，分析樣品對(duì)檢測(cè)的影響；分別取甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷各1 μl置入已加入1.0 ml二甲基亞砜的頂空瓶，密封，混合均勻，再分別進(jìn)樣，記錄各溶劑的保留時(shí)間，用于各個(gè)溶劑峰的定性；取標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，并記錄各溶劑出峰順序、保留時(shí)間，計(jì)算相鄰溶劑峰的分離度R，判斷各溶劑之間無(wú)干擾，則各相鄰溶劑之間分離度R均應(yīng)大于1.5；取樣品空白0.10 g加入標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 ml溶解，再進(jìn)樣，若判斷樣品空白對(duì)殘留溶劑分離度無(wú)影響，則各相鄰溶劑峰的分離度R均應(yīng)大于1.5，且與未加入樣品時(shí)所得分離度無(wú)明顯差異。

結(jié)論：標(biāo)準(zhǔn)溶液中出峰順序依次為甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷；保留時(shí)間依次為1.939，6.442，8.017 min；空白溶液在各溶劑出峰時(shí)間均無(wú)干擾峰，溶劑（二甲基亞砜）對(duì)檢測(cè)無(wú)影響；樣品空白在各溶劑出峰時(shí)間均干擾峰，樣品對(duì)檢測(cè)無(wú)影響；分離度R甲醇-氯仿=24.3，R氯仿-1,2-二氯乙烷=6.2，均大于1.5，加入樣品對(duì)分離度無(wú)明顯影響，專屬性符合要求。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

稱取甲醇0.1932 g、氯仿0.0105 g、1,2-二氯乙烷0.0100 g，按照方法描述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，連續(xù)進(jìn)樣。計(jì)算待測(cè)溶劑的理論塔板數(shù)N；連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD。標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷的理論塔板數(shù)依次為3406，9063，11583；峰面積RSD依次為1.3%，2.3%和1.9%,均小于15.0%。方法系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。

2.6 精密度試驗(yàn)

按照2.5 項(xiàng)下系統(tǒng)適用性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以每個(gè)溶劑峰面積的RSD評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷峰面積RSD（n=6）分別為1.3%，2.3%和1.9%，均小于15.0%，方法的精密度良好。

2.7 線性關(guān)系試驗(yàn)

1,2-二氯乙烷標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取1,2-二氯乙烷0.0201 g置入已加入一定量二甲基亞砜的10 ml量瓶，用二甲基亞砜稀釋至刻度，混合均勻。

標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A：精密稱取甲醇0.3960 g、氯仿0.0246 g置入已加入一定量二甲基亞砜的100 ml量瓶，再加入1,2-二氯乙烷標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.0 ml，用二甲基亞砜稀釋至刻度，混合均勻。取標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液A 0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml分別置入100 ml量瓶，用二甲基亞砜稀釋至刻度，混合均勻，得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：從低濃度到高濃度，依次取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液各 1.0 ml置入20 ml頂空瓶，密封，混合均勻，得到系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)溶液制備3份。

分別取上述系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，120 ℃平衡30 min，分別進(jìn)樣。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的峰面積對(duì)其質(zhì)量（以μg計(jì),等于濃度×1.0 ml），使用Origin 5.0軟件進(jìn)行線性回歸，得到每個(gè)溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程及相關(guān)系數(shù)R。結(jié)果表明：甲醇在99～1188 ppm濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=7.718+8.861X，R=0.9999；氯仿在12.3～73.8 ppm濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=3.094X-0.153，R=0.9987；1,2-二氯乙烷在1.005～6.03 ppm濃度范圍內(nèi)，線性方程為Y=8.472X-0.080，R=0.9963。表明峰面積與濃度均呈良好線性關(guān)系。

2.8 準(zhǔn)確度和回收率試驗(yàn)

樣品空白的制備：取樣品（批號(hào)：0905034），研細(xì)，充分干燥，將其中殘留溶劑降至較低的水平。稱取樣品空白0.10 g，精密稱定，置入20 ml頂空瓶，精密加入二甲基亞砜 1.0 ml溶解，密封，混合均勻得樣品空白溶液。取2.7項(xiàng)下的No.2、No.6、No.7標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。標(biāo)準(zhǔn)溶液 取系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)項(xiàng)下的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

取20 ml頂空瓶9個(gè)，分為3組，每組3個(gè)，各精密稱取樣品空白0.10 g。分別取線性項(xiàng)下No.2，No.6，No.7標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液各1.0 ml,分別加入到每組頂空瓶中，使溶解，密封，混合均勻，得到相當(dāng)于限度20%，100%，120%測(cè)試溶液，測(cè)定。

計(jì)算方法 計(jì)算每個(gè)溶劑每個(gè)濃度的回收率，方法的回收率以3個(gè)濃度測(cè)定的回收率的平均值評(píng)價(jià)。計(jì)算公式如下。

注：Ai：測(cè)試溶液圖譜中溶劑(i)的峰面積；A01：溶劑空白圖譜中溶劑(i)的峰面積；A02：樣品空白圖譜中溶劑(i)的峰面積；ASi：標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜中溶劑(i)的平均峰面積；Ci：測(cè)試溶液中溶劑(i)的加入量，μg；CSi：標(biāo)準(zhǔn)溶液中溶劑(i)的量，μg。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

以每個(gè)溶劑的回收率評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果見表2。甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的回收率分別為98.5%，95.0%和98.1%，回收率的RSD分別為2.3%，2.5%和2.6%；每個(gè)溶劑的回收率均介于90.0%～110.0%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 檢測(cè)限和定量限

取線性測(cè)試項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步用溶劑稀釋，得到適當(dāng)濃度的溶液。在色譜系統(tǒng)下，分別進(jìn)樣，當(dāng)待測(cè)組分的信噪比為2～3倍時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度為該組分的最小檢測(cè)濃度；當(dāng)待測(cè)組分的信噪比為10～20倍時(shí)，對(duì)應(yīng)的濃度為該組分的最小定量濃度。甲醇、氯仿和1,2-二氯乙烷的檢測(cè)限分別為0.5 ppm，0.5 ppm和0.2 ppm，定量限分別為2 ppm，2.5 ppm和0.9 ppm。

2.10 耐用性

分別由兩名化驗(yàn)員（化驗(yàn)員1和化驗(yàn)員2），使用兩支同型號(hào)，不同色譜柱，改變色譜條件，柱溫提高和降低5%，流速提高和降低5%，分別進(jìn)行系統(tǒng)適用性驗(yàn)證。結(jié)果見表3。

表3 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

計(jì)算各溶劑峰面積的RSD（n＝6），以RSD評(píng)價(jià)方法的耐用性。結(jié)果表明，不同化驗(yàn)員用使用不同色譜柱；提高和降低柱溫，提高和降低流速，連續(xù)進(jìn)樣6針，RSD均小于15.0%，表明方法的耐用性良好。

3 樣品檢測(cè)

取4批氫化可的松樣品（批號(hào)：0905034，0905035，0905045，0905046），按照規(guī)定條件檢測(cè)。結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

本文參考中國(guó)藥典2015年版四部及相關(guān)文獻(xiàn)，采用氣相色譜頂空進(jìn)樣法測(cè)定氫化可的松中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷溶劑殘留，考察了儀器條件、方法學(xué)研究，線性、準(zhǔn)確度、精密度等均滿足要求，建立了測(cè)定溶劑殘留的檢測(cè)方法，對(duì)4批樣品進(jìn)行測(cè)定。表明該法靈敏度高、精密度好，可用于氫化可的松中甲醇、氯仿、1,2-二氯乙烷溶劑殘留的測(cè)定。