張錫霞，李永貴，王 晶

（山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點實驗室，山東 濟南 250101）

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效，用于肺癰吐膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒[1]。其功效主要與其抗病原微生物、抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用相關(guān)[2]。魚腥草的有效成分是其揮發(fā)性物質(zhì)，通過質(zhì)譜學(xué)確定其結(jié)構(gòu)，其主要有效成分為癸酰乙醛（魚腥草素）和2-十一烷酮(甲基正壬酮）[3]。癸酰乙醛具有抗病原微生物的活性，但由于化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易聚合，于是通過人工合成制得了癸酰乙醛的亞硫酸氫鈉加成物即魚腥草素鈉[4]。

魚腥草素鈉栓為乳白色或微黃色的卵形栓劑，為抗感染類藥，消炎效果好，副作用小，用于治療子宮頸糜爛有特效[5]。西安瀾泰藥業(yè)有限公司于2006年率先獲得了魚腥草素鈉栓的生產(chǎn)批準文號。

因魚腥草素鈉含有化學(xué)性質(zhì)活潑的醛酮結(jié)構(gòu)，易發(fā)生聚合、氧化等多種降解反應(yīng)。通過參考文獻，根據(jù)降解動力學(xué)及縮合反應(yīng)機制，魚腥草素中含有二分子羥醛縮合產(chǎn)物（二聚物），但二聚物為縮合過程中的中間過渡狀態(tài)，縮合產(chǎn)物以穩(wěn)定的魚腥草素鈉三聚物（三聚物）形式存在[6-7]。由于魚腥草素鈉栓國家標準WS-10001-（HD-1078）-2002中無有關(guān)物質(zhì)檢查項[8]，故將三聚物作為魚腥草素鈉栓有關(guān)物質(zhì)考察對象，參考縮合反應(yīng)機制，制備三聚物；同時通過氫譜、碳譜、質(zhì)譜，確定其結(jié)構(gòu)，建立了三聚物檢查的HPLC法，進行了相應(yīng)的方法學(xué)驗證[9]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀帶有LC-20AT型泵、SPD-20A型紫外檢測器、SIL-20A型自動進樣器、CTO-10AS vp型柱溫箱、LC SoLution液相色譜數(shù)據(jù)工作站（日本島津公司）；BT125D型電子天平（德國Sartorius公司）；pHSJ-3F型酸度計（上海雷磁儀器廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；艾柯實驗室超純水機（成都艾柯）。

1.2 試藥

魚腥草素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100247-199601）；魚腥草素鈉栓（自制，規(guī)格：20 mg，批號120301，120302，120303）；三聚物對照品（自制，批號：YXCSJW-1，純度：98.19%）；甲醇（山東禹王）；超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 三聚物對照品溶液的制備 精密稱取三聚物對照品約10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲，使完全溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密移取1 ml置入100 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取魚腥草素鈉栓10粒，切成小片，精密稱取適量（約相當于魚腥草素鈉0.02 g），置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使完全溶解，取出，放冷至室溫，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。將量瓶置冰水浴中冷卻20 min，以0.45 μm的有機濾膜過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液放至室溫，精密量取1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取魚腥草素鈉對照品約20 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲，使完全溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為魚腥草素鈉對照品儲備液。精密移取2.1.1項三聚物對照品儲備液1 ml，置入10 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密移取此溶液1 ml及魚腥草素鈉對照品儲備液1 ml，置入同一10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

采用YMC-Pack ODS A（4.6 mm×150 mm，5μm）色譜柱；以甲醇：水（99：1）為流動相，檢測波長為228 nm，柱溫35 ℃，流速1.4 ml/min，進樣體積為20 μl。系統(tǒng)適用性溶液的HPLC圖譜見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性溶液的液相色譜圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 耐用性試驗[10]取系統(tǒng)適用性溶液，通過改變色譜條件中色譜柱、流速、流動相比例、柱溫等因素，考察耐用性。在微小變動因素條件下，主峰與三聚物之間分離度良好，結(jié)果表明，該色譜條件耐用性良好。結(jié)果見表1。

表1 耐用性試驗結(jié)果表

2.3.2 檢測限與定量限測定 精密稱取三聚物對照品適量，加甲醇溶解并用流動相定量稀釋，制成不同梯度濃度的系列溶液，按2.2項色譜條件測定。測得魚腥草素鈉三聚物的檢測限為2.45 ng（S/N≈3）；定量限為8.16 ng（S/N≈10）。

2.3.3 破壞性試驗 分別取魚腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使完全溶解，分別加1 mol/L鹽酸溶液1 ml，2 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 ml，90 ℃水浴加熱1 h，冷卻，分別以1 mol/L氫氧化鈉溶液、2 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為制劑酸、堿破壞儲備液。取魚腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，90 ℃水浴加熱1 h，冷卻，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為制劑高溫破壞儲備液。取魚腥草素鈉栓1粒，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，加入30%雙氧水溶液1 ml，置90 ℃水浴放置5 min，冷卻，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為制劑氧化破壞儲備液。精密移取各破壞儲備液1 ml，置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為制劑破壞溶液。同法破壞空白基質(zhì)栓，按2.1項同法制備破壞前供試品、破壞前空白基質(zhì)栓溶液及三聚物對照品溶液，精密量取制劑破壞溶液、制劑破壞前供試品溶液、三聚物對照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法計算三聚物含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，制劑的高溫、酸、堿、氧化破壞樣品中各降解峰與主峰分離度良好，空白基質(zhì)對三聚物無干擾，表明本色譜條件適用于魚腥草素鈉栓三聚物的檢查。本方法具有專屬性。

表2 破壞性試驗結(jié)果表

2.3.4 線性與范圍 精密稱取魚腥草素鈉三聚物約10 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇少許，超聲使其溶解，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密移取5 ml，置50 ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗儲備液。精密移取儲備液1 ml置100 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，再精密移取1 ml置入10 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性試驗溶液1，分別精密移取線性試驗儲備液1，2，4，5，6 ml置50 ml量瓶，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液2，3，4，5，6。精密移取上述溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（X）對峰面積（Y）進行線性回歸，得回歸方程：Y=66 421X-309.41，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。表明三聚物在0.009 43～1.131 μg/ml范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 回收率試驗 取空白基質(zhì)栓10粒，切成小片，精密稱取適量（約相當于魚腥草素鈉栓一粒的重量），置入100 ml量瓶，加甲醇少許，將量瓶置熱水浴中，輕輕振搖使其完全溶解，取出，放冷至室溫，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。作為空白基質(zhì)栓儲備液。精密稱取魚腥草素鈉三聚物2，5，10 mg各3份，分別置入100 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 ml，分別置入10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取空白基質(zhì)栓儲備液續(xù)濾液及對照品儲備液1 ml，置入同一10 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。按2.1.1項制備三聚物對照品溶液。

精密量取三聚物對照品溶液及各供試品溶液20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，按外標法計算，即得，結(jié)果見表3。

2.3.6 精密度試驗 精密量取三聚物對照品溶液20 μl注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖及峰面積。峰面積RSD為1.05%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取供試品（批號120301），精密稱定，按2.1.2項方法制備供試品溶液，平行配制6分，分別取20 μl注入液相色譜儀，考察方法的重復(fù)性，計算RSD為1.01%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 溶液穩(wěn)定性試驗 精密量取三聚物對照品溶液20 μl，分別于0，2，4，6，8 h注入液相色譜儀。記錄色譜圖及峰面積，峰面積RSD為0.80%。表明溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 三聚物的測定

取魚腥草素鈉栓三批（批號：120301，120302，120303），按2.1項供試品溶液及三聚物對照品溶液，精密量取供試品溶液、三聚物對照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液色譜圖中如有與三聚物對照品溶液色譜圖中保留時間一致的峰，按外標法以峰面積計算，即得。結(jié)果分別是0.04%，0.04%，0.04%。

4 討論

4.1 測定波長的選擇

取魚腥草素鈉三聚物對照品適量，精密稱定，加甲醇成每1 ml中含4.12 μg的溶液；取魚腥草素鈉栓2粒，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含魚腥草素鈉0.01 mg溶液，以0.45 μm有機濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用；取空白基質(zhì)適量，精密稱定，同法配制。照分光光度法（中國藥典2015年版四部附錄0401）在200～400 nm波長范圍內(nèi)對以上各溶液進行掃描。結(jié)果表明，魚腥草素鈉三聚物對照品溶液以及魚腥草素鈉栓溶液均在228 nm處有最大吸收?？瞻谆|(zhì)無干擾，因此，選228 nm作為魚腥草素鈉三聚物檢查的波長。

4.2 流動相比例選擇

當用純甲醇做流動相時，基線不平，干擾三聚物測定，當用98%甲醇做流動相時，魚腥草素鈉出峰時間較晚，故選擇99%甲醇做魚腥草素鈉栓中三聚物測定的流動相。

4.3 方法評價

本方法專屬性強，準確度高，儀器重復(fù)性良好，可用于魚腥草素鈉栓三聚物檢查。