李文周，李一圣，陳艷艷，胡文會(huì)，肖增麗，范曉梅，邱書奇

(1.深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院，廣東 深圳 518116；2.深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東 深圳 518116； 3.暨南大學(xué)附屬深圳市寶安區(qū)婦幼保健院，廣東 深圳 518133)

咽喉清口含片是由金銀花、玄參、青果和胖大海等十多味藥材組成的中藥制劑，具有清熱解毒、化痰利咽的功能，臨床上用于外感風(fēng)熱型急性咽炎的治療，療效確切[1]。目前，該制劑主要通過薄層鑒別及綠原酸含量測(cè)定來控制產(chǎn)品質(zhì)量。然而，咽喉清口含片組方藥味較多，制備工藝過程中各藥味采用分組處理方式，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，僅以單一成分的含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制存在明顯不足，未能全面有效的控制該制劑的綜合質(zhì)量，已不能滿足日益嚴(yán)格的藥品質(zhì)量控制要求。因此，我們開展咽喉清口含片的色譜特征圖譜研究，并擬將其應(yīng)用至該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以期更好的對(duì)其質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性進(jìn)行控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695/2998高效液相色譜儀，Empower 3色譜工作站，國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(Sartorius BT 25s、Sartorius BSA124s)。

綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201314)、次野鳶尾黃素對(duì)照品(批號(hào)：111557-200602)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，甲醇、乙腈為色譜級(jí)。咽喉清口含片10批為深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院院內(nèi)制劑，由廣東五虎山藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，樣品批次見表1。

表1 10批咽喉清口含片樣品列表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 固定相為Waters Symmetry C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，0～5 min：乙腈13%，5～28 min:乙腈13%～57%，28～28.01 min：乙腈57%～13%，28.01～35 min:乙腈13%；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取咽喉清口含片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取1.5 g，加入甲醇30 mL，超聲提取30 min(250 W，50 kHz)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL完全轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯層，合并，蒸干，加甲醇5 mL使溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液[2]。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取綠原酸和次野鳶尾黃素適量，分別加甲醇制成每1 mL含綠原酸30 μg、含次野鳶尾黃素10 μg的對(duì)照品溶液[3]，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測(cè)定法 精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，記錄35 min色譜圖。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取同一份供試品溶液(批號(hào)：1605101)，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.26%，各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于2.78%，表明儀器精密度符合特征圖譜技術(shù)要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)：1605101)，分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)行測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.35%，各色譜峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于3.58%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定，符合特征圖譜技術(shù)要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取咽喉清口含片(批號(hào)：1605101)，按“2.2.1”項(xiàng)下所述方法制備成供試品溶液6份，按“2.3” 項(xiàng)下所述方法進(jìn)行測(cè)定，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.31%，各色譜峰的相對(duì)峰面積均小于4.72%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性，符合特征圖譜技術(shù)要求。

2.5 特征圖譜共有模式建立[4]取咽喉清口含片10批(見表1),分別制備供試品溶液，按上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，記錄色譜圖，并導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”，經(jīng)過多點(diǎn)矯正和數(shù)據(jù)匹配生成色譜特征圖譜共有模式，通過比對(duì)，確定20個(gè)共有特征峰，以對(duì)照品進(jìn)行指認(rèn)，確定其中5號(hào)峰為綠原酸，20號(hào)峰為次野鳶尾黃素。以綠原酸色譜峰為參照峰，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間(各共有峰保留時(shí)間與綠原酸峰保留時(shí)間之比)及各批次樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜的相似度(由相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算導(dǎo)出)。結(jié)果10批咽喉清口含片的HPLC色譜圖如圖1所示，其中R為共有模式標(biāo)準(zhǔn)圖譜。各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間見表2，相似度計(jì)算結(jié)果見表3所示。

結(jié)果顯示，10批咽喉清口含片樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜(見圖2)對(duì)比，其相似度均不低于0.97，表明該方法穩(wěn)定可靠，可應(yīng)用于該制劑的質(zhì)量控制。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，所有被測(cè)試的供試品圖譜，均應(yīng)有20個(gè)特征峰，且各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)如表2所示。

圖1 10批咽喉清口含片的HPLC色譜圖及其共有模式圖譜

圖2 咽喉清口含片HPLC標(biāo)準(zhǔn)特征圖譜及共有峰

表2 咽喉清口含片特征圖譜中各共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間表

表3 10批樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度

3 討論

3.1 相對(duì)于化學(xué)藥品成分組成的清晰明了，中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜難明，以單一成分為指標(biāo)對(duì)中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，常在科學(xué)性和合理性方面受到質(zhì)疑，為此業(yè)界也在不斷探索更加合理的質(zhì)量控制方法，其中，色譜特征圖譜質(zhì)控技術(shù)作為一種能更好體現(xiàn)中藥成分整體性的技術(shù)手段，近年來在中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的應(yīng)用越見廣泛[5]。咽喉清口含片處方由十多味中藥組成，在制備時(shí)，考慮到各藥味的不同性質(zhì)，采用了分組處理工藝，金銀花、玄參和青果等采用水提工藝，而射干、山豆根和錦燈籠等采用醇提工藝。分組處理工藝兼顧了組方藥味各自所含有效成分的特點(diǎn)，同時(shí)也對(duì)其質(zhì)量控制方法提出了更高的要求，尤其是在制劑制備過程的控制上，如何有效控制不同處理組中間產(chǎn)物的質(zhì)量，是我們必須重點(diǎn)考慮的問題。

咽喉清口含片此前的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要依賴多味藥材的薄層鑒別和綠原酸的含量測(cè)定，這顯然無法滿足我們對(duì)該制劑的質(zhì)量控制要求。該標(biāo)準(zhǔn)中，綠原酸為處方中君藥金銀花的主要有效成分，其含量測(cè)定結(jié)果可一定程度上反映水提組工藝和質(zhì)量情況，但醇提組的相關(guān)情況則為監(jiān)控盲點(diǎn)，那么是否再建立一個(gè)指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法？或者還有更合理的解決方案？基于此考慮，我們建立咽喉清口含片色譜特征圖譜質(zhì)控方法，并將其增補(bǔ)至制劑和中間品的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)中，應(yīng)用于制劑制備的全過程控制，以期更好的保證所生產(chǎn)制劑質(zhì)量的一致性和均一性。初步試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法合理可行，其有效應(yīng)用，可獲得良好效果。

3.2 必須指出，本試驗(yàn)僅使用連續(xù)生產(chǎn)的10批產(chǎn)品進(jìn)行研究測(cè)試，樣本量較少，考察仍然不夠充分。限于客觀條件，咽喉清口含片雖已獲得國(guó)家中藥六類新藥臨床批件，并完成臨床試驗(yàn)，但現(xiàn)階段仍然僅為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，生產(chǎn)批次不多，隨著后續(xù)生產(chǎn)批次的不斷增多，所建立的圖譜仍需不斷進(jìn)行驗(yàn)證完善。

3.3 本試驗(yàn)初步以綠原酸和次野鳶尾黃素對(duì)照品進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)，其中綠原酸為處方中君藥金銀花的主要有效成分，次野鳶尾黃素則為射干中主要有效成分之一[6]。兩種成分可分別在一定程度上反映水提組藥味和醇提組藥味的工藝和質(zhì)量情況，初步驗(yàn)證所建立的特征圖譜質(zhì)控方法。后續(xù)的試驗(yàn)中，考慮進(jìn)一步進(jìn)行多色譜峰歸屬指認(rèn)，再分別于細(xì)胞水平和動(dòng)物水平上，開展基于抗炎抗氧化作用的譜效關(guān)系探討[7-9]，以揭示咽喉清口含片的組方合理性和組分作用機(jī)制。

3.4 由于成分的復(fù)雜性，多數(shù)中藥制劑的HPLC特征圖譜洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，考慮到藥品生產(chǎn)過程中時(shí)間成本和有機(jī)試劑耗用量的節(jié)約，建立方法時(shí)，我們?cè)诒ＷC色譜峰分離情況的基礎(chǔ)上，盡量縮短樣品進(jìn)樣洗脫時(shí)間，控制整個(gè)過程的時(shí)長(zhǎng)，以提高效率。當(dāng)然，隨著色譜技術(shù)的進(jìn)步，控制時(shí)長(zhǎng)提高效率的方法已經(jīng)有了更多選擇，如利用超高效液相色譜(UPLC)來進(jìn)行分析等，但由于咽喉清口含片生產(chǎn)單位的條件限制，現(xiàn)階段乃至未來一段時(shí)期內(nèi)，HPLC法仍然不可替代，因此我們只能盡量控制其洗脫時(shí)長(zhǎng)。

3.5 試驗(yàn)過程中，我們?cè)跃G原酸和次野鳶尾黃素綜合轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對(duì)供試品溶液制備方法進(jìn)行考察，比較了甲醇提取后乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯直接提取的效果，結(jié)果乙酸乙酯直接提取所制備的供試品溶液，色譜信息不夠豐富，部分色譜峰極小，不利于積分統(tǒng)計(jì)，因此確定先以甲醇提取后加乙酸乙酯進(jìn)行萃取。在此基礎(chǔ)上又考察了提取溶劑(水、甲醇)、提取方式(超聲提取、加熱回流提取)、提取時(shí)間、萃取次數(shù)、萃取溶劑用量等條件，結(jié)果確定供試品溶液制備方法如正文所示。