韓艷茹，賈奎，趙福成

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺血性卒中是因多種病因造成腦動脈閉塞導致腦組織缺血缺氧，進而導致腦組織出現(xiàn)興奮性毒性、線粒體功能失調(diào)、氧化應(yīng)激、炎癥、離子失衡及酸中毒，最終導致腦組織不可逆性損傷，神經(jīng)細胞壞死，出現(xiàn)神經(jīng)功能及認知功能缺失[1，2]。缺血所引起的腦組織損傷是致死性疾病的主要原因，是全世界第三大致死疾病之一，具有高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率及高復發(fā)率的特點[3，4]。其中，缺血再灌注損傷發(fā)生在急性腦梗死恢復血液供應(yīng)后，重新獲得血液供應(yīng)的腦組織內(nèi)的神經(jīng)細胞死亡增多，腦組織損傷加重。近些年來，許多中藥被發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注早期可緩解腦組織損傷情況，并可減少海馬細胞的死亡[5，6]。因此，本研究旨在探究清腦益元湯大鼠腦梗死缺血再灌注中的主要作用機制，及對腦內(nèi)HIF-1α、VEGF、PDGF調(diào)節(jié)情況。

1 材料與方法

1.1 大鼠MACO模型制備[7]45只成年雄性Wistar大鼠SPF級 （購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司）。相對濕度40%～70%，晝夜12h循環(huán)光照，溫度適宜。將SD大鼠按設(shè)計方案分成組，每組3組，每組15只；隨機分為對照組、模型組、清腦益元湯組。采用灌胃方法在造模后分別灌注14d等劑量的生理鹽水或清腦益元湯。采用10%水合氯醛行大鼠腹腔注射麻醉（35mg/kg），仰臥位固定大鼠，切開皮膚病分離左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），在CCA遠心端近心端及ECA處掛線備用。用動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結(jié)扎 CCA、ECA。然后在距 CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在18mm時，緊緊系牢CCA遠心端的細線。栓塞1h后，打開栓塞制作再灌注模型。做完模型后，終止麻醉，將所有大鼠歸放籠里。

清腦益元湯：水牛角30g、水蛭 8g、赤芍 15g、參三七 10g、川牛膝 15g、紫河車 15g、紅景天 20g、干地黃10g、制首烏10g、肉蓯蓉10g。煎藥直至其變?yōu)楦酄睿幬餄舛群?g/ml。大鼠按照3ml/100g清腦益元湯灌胃14d，對照組和模型組給予等劑量生理鹽水灌胃。

1.2 大鼠Longa評分[8]動物蘇醒后，參照Longa等評分標準進行神經(jīng)功能缺陷評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分為模型成功，0分和4分予以剔除，并在后續(xù)實驗中補足每組動物數(shù)。

1.3 采樣與指標檢測 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，留取大腦海馬組織，中性福爾馬林（10%）固定，常規(guī)組織脫水和浸蠟包埋，石蠟5μm/張切片連續(xù)6張，切片用于HE染色和TTC檢測觀察腦組織形態(tài)變化和顏色變化，計算梗死面積。

1.4 Western Blot檢測蛋白表達水平 離心大鼠腦組織提取海馬區(qū)蛋白，調(diào)整每一組的蛋白濃度總量為30ug/uL。各組蛋白樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，加入大鼠多克隆抗體 HIF－1α、VEGF、PDGF和二抗。顯色使用 ECL顯色劑，成像使用Bio－Pro凝膠成像分析儀，各泳道條帶進行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達量用Quantity－one軟件進行分析。

1.5 Real－Time PCR 法檢測基因表達 Trizol法提取大鼠腦組織內(nèi)總RNA。按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行實時熒光定量Real－time PCR分析。每個實驗HIF－1α、VEGF、PDGF至少重復3次。 分析：通過計算 HIF－1α、VEGF、PDGF 得到循環(huán)閾值CT值來確定基因的表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 本實驗各組數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件處理，對數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料，計量資料結(jié)果用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析和Bonferroni "s Multiple Comparison Test進行組間差異比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)組織學評分結(jié)果 對照組大鼠腦組織呈均勻紅色，未見蒼白缺血區(qū)；模型組損傷腦組織可見蒼白梗死灶，且缺血灶范圍隨再灌注時間的延長而擴大；清腦益元湯組大鼠腦組織缺血面積明顯減少。與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠Longa評分明顯增高，梗死面積（%）明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 與模型組相比，清腦益元湯組大鼠Longa評分明顯降低，梗死面積（%）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 大鼠神經(jīng)組織學評分結(jié)果

2.2 HE染色結(jié)果 對照組大鼠腦海馬回神經(jīng)細胞胞膜、核膜清晰，核仁明顯細胞形態(tài)無異常。模型組大鼠神經(jīng)細胞，多無完整的細胞結(jié)構(gòu)，呈不同程度的缺血性壞死，細胞核固縮，染色質(zhì)濃縮集聚，甚至形成核碎片，星形膠質(zhì)細胞呈簇樣增生。清腦益元湯組缺血區(qū)神經(jīng)細胞腫脹程度、間隙及細胞核改變均較輕，腦缺血區(qū)僅有輕、中度缺血性改變，缺血區(qū)腦梗死現(xiàn)象明顯減輕。見圖1。

2.3 Western blot法檢測蛋白表達結(jié)果 與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF－1、VEGF、PDGF的蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組HIF－1蛋白含量明顯降低，VEGF、PDGF蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖 2。

圖1 HE染色結(jié)果(400×)

圖2 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF的蛋白表達含量

2.4 Real-Time PCR法檢測蛋白表達結(jié)果 與對照組相比，模型組和清腦益元湯組大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA 含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，清腦益元湯組 HIF-1 mRNA含量明顯降低，VEGF、PDGF mRNA含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。 見圖 3。

圖3 大鼠腦組織中HIF-1、VEGF、PDGF mRNA表達水平

3 討論

中醫(yī)藥現(xiàn)如今在干預和治療腦組織疾病中具有顯著療效，不僅可以活血化瘀、解毒清腦，幫助機體恢復腦內(nèi)血流量，改善腦缺血損傷的局部微環(huán)境，改善腦缺血損傷程度；還可以益腎填精、補腎生髓，用于修復和改善缺血壞死的腦神經(jīng)元，降低神經(jīng)功能缺損。清腦益元湯由水牛角、水蛭、赤芍、參三七、川牛膝、紫河車、紅景天、干地黃、制首烏、肉蓯蓉10味中藥組成，水牛角清熱涼血解毒；水蛭破血逐瘀、活血通絡(luò)；赤芍清熱涼血；參三七活血化瘀；川牛膝活血通經(jīng)絡(luò)；紅景天活血化瘀、健脾益氣；紫河車補腎益精、補氣益血；地黃、制首烏及肉蓯蓉填精益髓益腎固元，功效為清腦祛瘀、益腎生髓，使腦絡(luò)通暢，局部血液供應(yīng)改善，梗死體積縮小，神經(jīng)功能缺損加速修復，擬用于腦缺血損傷大鼠急性期和恢復早期階段的防治[9-11]。

HIF-1α是機體在低氧狀態(tài)下做出適應(yīng)性反應(yīng)的細胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)性因子。缺氧時HIF-1α在細胞核內(nèi)與HIF-1β聚合成HIF-1，HIF-1與血管內(nèi)皮因子結(jié)合介導VEGF的轉(zhuǎn)錄激活，激活相關(guān)的缺血缺氧轉(zhuǎn)導通路，促進受損腦組織中新生血管生成[12，13]。 同時，HIF-1α可參與介導顱腦損傷中的神經(jīng)元凋亡作用。HIF-1α是一種用于檢測低氧環(huán)境的細胞轉(zhuǎn)錄因子，在顱腦損傷所致的缺血缺氧腦損傷發(fā)生、發(fā)展過程中HIF-1α發(fā)揮著十分重要的作用。在發(fā)生了腦缺血損傷后，相比于損傷發(fā)生之前，大腦內(nèi)VEGF的表達顯著的提高[14]。VEGF作為目前最強的血管通透因子，通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖、增加血管的通透性，能夠被激活或者直接促進血管的生成，研究表明VEGF能夠提高機體腦組織內(nèi)神經(jīng)干細胞的存活和促進細胞增殖[15，16]。血小板衍生因子（PDGF）在結(jié)締組織細胞參與傷口愈合時表達明顯升高，PDGF通過增強機體內(nèi)炎性細胞和成纖維細胞的合成和分泌，進而促進細胞外基質(zhì)蛋白和膠原蛋白的形成，可以大大降低傷口愈合的時間。國內(nèi)外研究表明，PDGF及其受體能夠促進毛細血管壁的形成和穩(wěn)定，促進血管生成和血管重建，并可通過促進少突膠質(zhì)細胞的增殖，能對細胞起保護作用，緩解腦部損傷[17，18]。

本研究結(jié)果表明，清腦益元湯可以有效緩解Longa評分，并可以有效改善大鼠的行為學變化，減輕大鼠腦組織腦缺血損傷情況，改善損傷海馬區(qū)不同程度的缺血性壞死和神經(jīng)元損傷。清腦益元湯能夠顯著降低大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)HIF-1α含量表達，并促進VEGF、PDGF mRNA和蛋白含量表達以改善大鼠腦缺血再灌注損傷，促進腦內(nèi)新生血管生成，保護腦內(nèi)神經(jīng)元。綜上所述，清腦益元湯對腦損傷大鼠的治療作用可為腦梗死的臨床治療提供新的理論依據(jù)、可能思路和靶向藥物。