孫麗娟，王婷婷，呂瑩，楊瑞，李曉雙，于麗

（濰坊醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，山東省神經(jīng)疾病與再生修復重點實驗室，濰坊 261053）

PM2.5（空氣動力學直徑不超過2.5μm 的顆粒物質(zhì)）是空氣污染的主要成分，可對人類健康構(gòu)成嚴重危害。孕婦及其胎兒屬于非常脆弱的群體，特別容易受到空氣污染物的影響。妊娠期暴露于高濃度PM2.5環(huán)境會引起母體炎癥反應(yīng)及不良妊娠結(jié)局[1，2]。近期研究表明，PM2.5與中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）疾病的發(fā)生密切相關(guān)，而神經(jīng)炎癥可能是PM2.5引起神經(jīng)損傷的主要機制之一[3]。NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域3（NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3）炎性小體是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達的亞細胞多蛋白復合物，被認為是神經(jīng)炎癥發(fā)展的關(guān)鍵因素[4]。研究表明，補充B 族維生素可以減少PM2.5對心臟自主神經(jīng)功能障礙和炎癥標志物的急性作用[5]。而B 族維生素是否可通過抑制NLRP3炎性小體通路減輕PM2.5所致孕婦神經(jīng)炎癥和腦損傷，目前尚不明確。

本研究建立了孕期PM2.5損傷動物模型，并給予B 族維生素干預，探討NLRP3 炎性小體在VB 干預孕期PM2.5致神經(jīng)炎癥中的表達變化，將為尋找減輕 PM2.5污染所致孕婦腦損傷提供一種新的營養(yǎng)干預手段。

材料與方法

1 PM2.5 標本的采樣和處理

使用大氣顆粒物采樣器，收集2017 年12 月至2018 年1 月采暖季某地級市城區(qū)大氣PM2.5，制備樣品的方法參考課題組前期的研究[6]。將顆粒物過濾膜切成小塊，在低溫下用去離子水處理。超聲波振蕩四次（每次30min）。然后收集洗脫液并在真空中冷凍干燥，將冷凍干燥的粉末保存在-20℃，使用時以PBS 為溶劑配成需要的濃度，超聲振蕩混勻。

2 實驗動物和模型制備

SPF 級 ICR（Institute of Cancer Research）小鼠，8-9 周齡，購于山東省濟南實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：自由飲水進食，室溫25℃左右。

將雌雄小鼠按2：1 合籠，次日雌鼠查出陰栓者即為妊娠第一天 (E0.5) 。將孕鼠隨機分為對照組、模型組和干預組。對照組（control）：給予PBS 灌胃；模型組（PM2.5）參照課題前期方法[7]氣管滴注濃度為3.456 μg/μl 的30 μl PM2.5混懸液（相當于2016 年冬季某地區(qū)PM2.5最高值1000 μg/m3），PBS灌胃；干預組（PM2.5+VB）：氣管滴注相同劑量的PM2.5混懸液，VB 灌胃[葉酸：0.6 mg/（kg·d）、維生素B6：11.4 mg/（kg·d）、維生素B12：0.2 mg/（kg·d）]，VB 混合液的制備參考文獻根據(jù)人的劑量等效換算為小鼠[16]。從妊娠期第1d 開始，每天進行灌胃(E0.5-E17.5)。

3 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR

待孕鼠分娩后，分離其大腦皮層，勻漿，TRIzol試劑提取總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄。使用第一鏈cDNA 合成試劑盒合成cDNA。在cfx-manager 3.1 系統(tǒng)上，使用SYBR 預混料Ex Taq II 試劑盒進行實時RT 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。用2-ΔCT 法測定mRNA 的變化。NLRP3、IL-1β 和caspase-1 逆轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)參考之前的程序進行[7]，引物由上海生工生物工程股份有限公司提供（表1）。

表1 RT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer Sequences for RT-PCR

4 Western blot

孕鼠分娩后，分離其大腦皮層，加入RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)，12% SDS-PAGE凝膠電泳。300 mA恒流轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉2h，一抗孵育4 ℃過夜：兔源NLRP3 多克隆抗體（1∶200），兔源的cleaved caspase-1 多克隆抗體（1∶200），兔源GAPDH 單克隆抗體（1∶2000）。TBST 洗滌，加入HRP 標記羊抗兔IgG（1∶2000），室溫孵育2h。ImageJ 凝膠分析工具定量分析條帶光密度。樣本中目的蛋白的含量以目的蛋白光密度值/GAPDH 光密度值反映。

5 炎性因子的ELISA 檢測

分離孕鼠大腦皮層，提取蛋白，標準品和樣品中的IL-1β 與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗小鼠IL-1β，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin 與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，檢測450nm 處的OD值，基于標準曲線計算IL-1β 的濃度。

6 免疫熒光染色

孕鼠分娩后，用5%的水合氯醛麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，完整剝離鼠腦，制備15μm 冰凍切片。PBS 洗片5min×3 次，微波抗原修復，10%羊血清37℃封閉1h，一抗孵育4 ℃過夜：兔源NLRP3多克隆抗體（1∶150），兔源cleaved caspase-1 多克隆抗體（1∶200），根據(jù)一抗種屬滴加Alexa Fluor 488 標記的羊抗兔 IgG（1∶200)，37 ℃避光孵育1h，Hoechest 染核，37 ℃孵育25min，封片觀察。

7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均為均數(shù)± 標準誤表示，應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析（ANOVA），采用Tukey 檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05 被認為具有顯著性差異。

結(jié) 果

1 B 族維生素干預降低PM2.5 暴露對孕鼠大腦皮層NLRP3 和caspase-1、IL-1β 轉(zhuǎn)錄的上調(diào)

實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示：給予PM2.5暴露后，模型組孕鼠大腦皮層NLRP3、IL-1β mRNA 表達水平明顯高于對照組；PM2.5暴露同時給予VB 干預，干預組孕鼠大腦皮層NLRP3、IL-1β mRNA 表達水平則明顯低于模型組，但與對照組相比無明顯變化（圖1A、B）。各組總caspase-1 的轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異（圖1C）。

2 B 族維生素干預降低PM2.5 暴露對孕鼠大腦皮層NLRP3 和cleaved caspase-1 水平的上調(diào)

Western blot 結(jié)果顯示：給予PM2.5暴露后，模型組孕鼠大腦皮層中NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白表達明顯高于對照組；PM2.5暴露同時給予VB干預，干預組孕鼠大腦皮層中NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白表達明顯低于模型組，但與對照組相比變化不明顯（圖1E-H）。

免疫熒光結(jié)果顯示：NLRP3 和cleaved caspase-1均表達于大腦皮層細胞的胞質(zhì)內(nèi)，模型組孕鼠大腦皮層NLRP3 和cleaved caspase-1 免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)及熒光強度均強于對照組；B 族維生素干預組孕鼠大腦皮層NLRP3 和cleaved caspase-1 免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)及熒光強度均弱于模型組，但與對照組相比無明顯差異（圖2）。

3 B 族維生素干預降低PM2.5 暴露對孕鼠大腦皮層炎性因子IL-1β 水平的上調(diào)

ELISA 檢測發(fā)現(xiàn)：給予PM2.5暴露后，模型組孕鼠大腦皮層IL-1β 表達量明顯多于PBS 對照組；PM2.5暴露同時給予VB 干預，干預組孕鼠大腦皮層IL-1β 的表達量明顯低于模型組，但與對照組相比無顯著差異（圖1D）。

討 論

細顆粒物（PM2.5）是一種對全球公共健康構(gòu)成重大危害的空氣污染物。越來越多的證據(jù)表明，PM2.5暴露不僅會損害大腦，加速認知老化，而且可誘導小鼠腦損傷，增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，加重小鼠大腦神經(jīng)炎癥[8-10]。據(jù)報道，妊娠期暴露于PM2.5會導致促炎因子表達增加，引起孕鼠全身炎癥反應(yīng)，而炎癥已被確定為多種神經(jīng)疾病的致病因素[17,18]。研究表明NLRP3 炎性小體通路參與了神經(jīng)疾病，NLRP3 炎性小體是一種調(diào)節(jié)IL-1β 前體分裂的胞質(zhì)多蛋白復合物，可以導致caspase-1 的活化，其過度激活可能導致各種疾病的發(fā)生和發(fā)展[11,12]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期大氣細顆粒物暴露致孕鼠多種器官出現(xiàn)炎癥等病理損害[13]。為闡明顆粒物暴露致孕鼠腦損傷的炎癥通路，我們檢測了孕鼠大腦皮層NLRP3 炎性小體通路相關(guān)因子的表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露后孕鼠大腦皮層NLRP3、IL-1β mRNA 表達水平明顯升高，且PM2.5模型組的NLRP3、cleaved caspase-1 和IL-1β 的蛋白表達明顯高于對照組。結(jié)果表明妊娠期暴露于PM2.5可能導致孕鼠NLRP3 炎性小體通路被激活，可進一步引起下游因子caspase-1 的活化，活化的caspase-1可促進最終產(chǎn)物IL-1β 加工并驅(qū)動炎癥反應(yīng)和細胞焦亡的發(fā)生，進而導致腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體是一種亞細胞多蛋白復合物，其形成和活化可能由多種物質(zhì)誘導，活化的NLRP3 炎性小體激活caspase-1，促進炎性細胞因子IL-1β 的分泌，并誘導細胞焦亡[14]，這與我們上述結(jié)果是一致的。因此，NLRP3 炎性小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

圖1 各組孕鼠大腦皮層中NLRP3、IL-1β 和caspase-1 表達水平檢測。A-C， NLRP3、IL-1β、caspase-1 mRNA 含量；D，IL-1β 表達量；E和F， NLRP3 和cleaved caspase-1 含量；G 和H，NLRP3 和cleaved caspase-1 相對水平的統(tǒng)計學分析。*，P＜0.05；**，P＜0.01；n=3Fig. 1 Detection of expression levels of NLRP3, IL-1β and caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant mice in each group. A to C, mRNA levels of NLRP3, IL-1β, caspase-1; D, expression level of IL-1β; E and F, protein levels of NLRP3 and cleaved-caspase-1; G and H, statistical analysis for relative levels of NLRP3 and cleaved caspase-1; *, P＜0.05；**, P＜0.01；n=3

圖2 各組孕鼠大腦皮層NLRP3、cleaved caspase-1 表達的免疫熒光檢測。A1、B1、C1，對照組、模型組、干預組孕鼠大腦皮層NLRP3 的表達情況。A2A3、B2B3、C2C3，分別為A1、B1、C1 中方框內(nèi)放大圖像。D1、E1、F1，對照組、模型組、干預組孕鼠大腦皮層cleaved caspase-1 的表達情況。D2D3、E2E3、F2F3，分別為D1、E1、F1 中方框內(nèi)放大圖像。比例尺：A1-C1, 50μm; A2-C2 和 A3 -C3, 25μm；D1-F1, 50μm；D2 -F2 和D3- F3, 25μmFig. 2 Immunofluorescence detection for expression of NLRP3 and cleaved caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant mice. A1, B1, C1, the expression of NLRP3 in the cerebral cortex of the control group, the model group and the intervention group. A2A3、B2B3、C2C3 are respectively the enlarged images in the box of A1, B1 and C1. D1, E1, F1, the expression of cleaved caspase-1 in the cerebral cortex of pregnant rats in the control group, model group and intervention group. D2D3, E2E3, F2F3 are respectively the enlarged images in the boxes of D1, E1 and F1. Scale bar∶ A1 to C1, 50μm; A2 to C2 and A3 to C3, 25μm; D1 to F1, 50μm；D2 to F2 and D3 to F3, 25μm

少量人體研究表明，環(huán)境PM2.5暴露對機體的某些不利影響可能通過補充B 族維生素來中和[16]，但確切機制及是否可以預防PM2.5暴露所致腦損傷，目前尚不明確。B 族維生素被認為具有抗炎、抗氧化的特性和免疫表觀遺傳效應(yīng)[17]，因而我們推測B族維生素可能對空氣污染引起的疾病也有一定的保護作用。本研究建立了妊娠期B 族維生素干預PM2.5損傷動物模型，探討B(tài) 族維生素是否可作為營養(yǎng)干預措施緩解PM2.5所致的孕鼠腦損傷。我們的結(jié)果顯示，孕期給予一定的B 族維生素干預后，暴露于同樣的PM2.5環(huán)境，孕鼠大腦皮層NLRP3、cleaved caspase-1 的表達受到抑制，炎性因子IL-1β 的表達明顯降低，說明神經(jīng)炎癥得到緩解?？梢?，妊娠期B族維生素補充后，可以抑制PM2.5暴露所致孕鼠大腦皮層NLRP3 炎性小體相關(guān)因子的表達，神經(jīng)炎癥損傷得到改善，趨近于正常水平。因此，我們推測，B族維生素可減輕孕期PM2.5暴露誘導的孕鼠神經(jīng)炎癥，對PM2.5暴露所致的孕鼠腦損傷有保護作用，可能通過抑制NLRP3 通路的激活緩解腦損傷。

綜上所述，孕期PM2.5暴露可導致孕鼠大腦皮層NLRP3 炎性小體通路的激活，參與神經(jīng)炎癥的發(fā)生，而B 族維生素可能通過抑制NLRP3 炎性小體通路激活，從而減少炎性因子的合成和分泌。因此我們應(yīng)該針對孕婦開展形式多樣的健康教育，從而保證妊娠期B 族維生素正常攝入, 有效預防和治療孕婦神經(jīng)炎癥，降低不良環(huán)境因素導致的孕婦腦損傷發(fā)生率，促進胎兒正常發(fā)育。