李軍建，陳鋼，朱千東，余正平

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

胰腺癌的惡性程度高，現(xiàn)有治療手段未能有突破性進(jìn)展[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如白血病、乳腺癌、肝癌、胃癌等領(lǐng)域相繼發(fā)現(xiàn)相關(guān)異常表達(dá)的miRNA及其靶基因[4-6]。有研究表明，一些miRNA在胰腺癌中同樣存在異常表達(dá)[7]，但目前為止尚未明確發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的靶基因以及如何影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。miR-181a是人類細(xì)胞中存在較為廣泛的一類miRNA，對(duì)維持胸腺細(xì)胞分化狀態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8-9]。胰腺癌miRNA表達(dá)譜研究顯示，miR-181a在胰腺癌組織中呈現(xiàn)顯著高表達(dá)，提示miR-181a可能參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖凋亡[10]。miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)靶基因預(yù)測(cè)提示ADP核糖基化輔助因子（collaborator of ADP-ribosylation factor，CARF）基因是miR-181a可能的作用靶點(diǎn)，該基因可通過多條途徑發(fā)揮上調(diào)p53的作用，而p53通路是胰腺癌發(fā)病機(jī)制的重要組成部分[11-12]。本研究觀察miR-181a與CARF基因的相互作用，探討兩者之間是否存靶向關(guān)系及其在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 胰腺癌細(xì)胞株（Panc I）、正常胰腺細(xì)胞株（CCC-HPE-2）由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院肝膽胰外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；胰腺癌及正常胰腺組織標(biāo)本均取自于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科臨床手術(shù)切除標(biāo)本；雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)（Dual-LuciferaseReporter Assay System），包括質(zhì)粒pGL-3/Control、pRL-TK，各種內(nèi)切酶及連接酶，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒等均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、100×青鏈霉素（雙抗）溶液等均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DNA純化試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，PCR相關(guān)引物合成和基因測(cè)序均委托上海生工公司協(xié)助完成。miR-181a拮抗劑（miR-181a inhibitor）和激動(dòng)劑（hsa-miR-181a）及空白對(duì)照（miRNA Neg-tive Control）委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。本研究經(jīng)過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA的提取及miRNA-181a的定量檢測(cè)：采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取正常胰腺細(xì)胞株CCC-HPE-2和胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc I（各8個(gè)樣本），及正常胰腺組織和胰腺癌組織（各20例）中的總RNA（富集miRNA），依照Tiangen試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-181a，以U6為內(nèi)參，其引物序列代號(hào)MS00007497，hsa-miR-181a引物序列代號(hào)MS00003213（均購(gòu)自美國(guó)Ambion公司）。反應(yīng)條件為95 ℃、30 s預(yù)變性，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，凝膠成像后做定量分析。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及分組：常規(guī)培養(yǎng)Panc I細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種于24孔板[（3～5）×105個(gè)細(xì)胞/孔]，更換孔板中培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯集度約80%時(shí)開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染完成4 h后再更換成含胎牛血清的培養(yǎng)基，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。分為3組：按照通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor拮抗劑（PMI組），miRNA Negative Control陰性對(duì)照（PMNC組）和單純質(zhì)粒的空白對(duì)照（NC組）。胰腺癌組織標(biāo)本為C組，正常胰腺組織為N組，CCCHPE-2細(xì)胞為CCC-HPE-2組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞：NC組、PMNC組、PMI組置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下，以每孔細(xì)胞數(shù)約為5×104的量接種于相應(yīng)的96孔板。常規(guī)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔分別加入20 μL 5 mg/mL MTT試劑，同樣條件再孵育4 h，每孔加入100 μL DMSO，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值，上述實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次。

1.2.4 制備含有CARF 3’-UTR片段的pGL-3轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：采用上游引物P1（5’-ATCATACGCGTTGAATAAACCA CATCAAAGGAAAGG-3’）以及下游引物P2（5’-TGTAAGAT CTTTACGGGCAACATTTTTAAAACC-3’），用PCR法從全基因組DNA中擴(kuò)增完整的CARF 3’-UTR片段P2，將純化的PCR產(chǎn)物與TAKARA pMD18-T vector連接。將包含CARF 3’-UTR片段的pGL-3質(zhì)粒和PMD-18T載體質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，然后混勻，離心后37 ℃常溫環(huán)境下酶切過夜。所得酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳（電壓為5 V/cm），電泳完成后將凝膠上的目的片段切下，凝膠DNA回收。所得純化pGL-3質(zhì)粒片段（60 ng/μL）和CARF 3’-UTR片段（30 ng/μL）通過T4連接酶連接。

1.2.5 熒光素酶檢測(cè)miR-181a拮抗劑和激動(dòng)劑對(duì)miR-181a水平的影響：采用Trans Fast脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入胰腺癌細(xì)胞Panc I，以不包含CARF 3’-UTR序列的PGL3-control質(zhì)粒作為陰性對(duì)照，單純脂質(zhì)體為空白對(duì)照，具體分組情況如下：Panc I A：PGL3-control；Panc I B：PGL3-CARF 3’-UTR；Panc I C：PGL3-CARF 3’-UTR+10 nmol/L拮抗劑（miR-181a inhibitor）；Panc I D：PGL3-CARF 3’-UTR+10 nmol/L激動(dòng)劑（hsa-miR-181a）；Panc I E：PGL3-CARF 3’-UTR+30 nmol/L激動(dòng)劑（hsa-miR-181a）。

上述每種處理分別設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性，結(jié)果以相對(duì)于內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pRL-TK的百分比表示。

1.2.6 激動(dòng)劑及拮抗劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞中miR-181a表達(dá)水平的影響：設(shè)定3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：PM組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染10 nmol/L激動(dòng)劑hsa-miR-181a上調(diào)miR-181a水平），PMI組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染10 nmol/L抑制劑miR-181a inhibitor下調(diào)miR-181a水平）和對(duì)照組PNC組細(xì)胞（未處理），應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)情況，檢測(cè)方法及條件參照1.2.1。

1.2.7 Western blot檢測(cè)miR-181a對(duì)CARF蛋白表達(dá)水平的影響：應(yīng)用Western blot檢測(cè)3組采用不同干預(yù)手段的細(xì)胞內(nèi)CARF基因的蛋白表達(dá)水平：PM組、PMI和PNC組。消化收集上述各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取總蛋白，制膠后總蛋白上樣50 mg，電泳跑膠（濃縮膠80 mA、20 min，分離膠120 mA、1 h），結(jié)束后取出凝膠，300 mA電轉(zhuǎn)約2 h，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF上，脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)移膜l h后加一抗，4 ℃過夜，TBST漂洗4次，然后加二抗，室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜4次，完成后電化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間比較用t檢驗(yàn)；3組間不同時(shí)間點(diǎn)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較用S-N-K法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌中miR-181a的表達(dá)水平 C組中的miR-181a的表達(dá)量明顯高于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.015±0.010 vs. 0.003±0.002，P＜0.05）。胰腺癌Panc I細(xì)胞中的miR-181a表達(dá)水平明顯高于CCCHPE-2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.016±0.004 vs.0.006±0.002，P＜0.05）。

2.2 Panc I細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染72 h后超過80%的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，可見綠色熒光，轉(zhuǎn)染效果較佳，見圖1。

2.3 拮抗劑miR-181a inhibitor下調(diào)胰腺癌細(xì)胞的增殖水平 PMNC組各時(shí)間點(diǎn)間的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PMI組的Panc I細(xì)胞在24、48、72 h等3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)生長(zhǎng)均受到明顯抑制，與PMNC組和NC組比較各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Panc I細(xì)胞后顯示綠色熒光（×100）

圖2 轉(zhuǎn)染后3組各時(shí)間點(diǎn)Panc I細(xì)胞生長(zhǎng)情況比較

2.4 miR-181a對(duì)重組質(zhì)粒PGL3-CARF 3’-UTR熒光素酶活性的影響 Panc I A組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒PGL3-control后不影響熒光素酶活性而使其正常表達(dá)。Panc I B組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGL3-CARF3’-UTR與Panc I A組比熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Panc I C組細(xì)胞同時(shí)加入拮抗劑miR-181a inhibitor，細(xì)胞內(nèi)miR-181a受抑制，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與Panc I A組比，Panc I D加入10 nmol/L激動(dòng)劑hsa-miR-181a，細(xì)胞內(nèi)miR-181a水平上升，熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Panc I A組比，Panc I E加入30 nmol/L激動(dòng)劑hsa-miR-181a，細(xì)胞內(nèi)miR-181a水平上升，熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Panc I D與Panc I E 2組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和不同劑量的激動(dòng)劑hsa-miR-181a，隨著激動(dòng)劑劑量的增加miR-181a也隨之上升，熒光素酶活性明顯下降，兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.92，P＜0.05）。見圖3。

2.5 激動(dòng)劑及拮抗劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞中miR-181a表達(dá)水平的影響 PM組細(xì)胞miR-181a表達(dá)水平較PNC組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.039±0.004 vs.0.015±0.004，P＜0.05）；而PMI組細(xì)胞miR-181a表達(dá)水平較PNC組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.008±0.002 vs. 0.015±0.004，P＜0.05）。

圖3 miR-181a對(duì)重組質(zhì)粒PGL3-CARF3’-UTR熒光素酶活性的影響

2.6 miR-181a水平對(duì)CARF蛋白表達(dá)的影響 與PNC組比，PM組CARF蛋白表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與PNC組比，PMI組CARF蛋白表達(dá)明顯加強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 miR-181a對(duì)CARF蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

本研究證實(shí)胰腺癌組織/細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織/細(xì)胞；以往研究表明大多數(shù)miRNA通過改變腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡情況，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]，結(jié)合miR-181a在胰腺癌中的高表達(dá)，采用miR-181a的拮抗劑miR-181a inhibitor轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的增殖活性得到明顯抑制。miR-181a inhibitor的序列與miR-181a互補(bǔ)，可以與細(xì)胞內(nèi)成熟miR-181a序列結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)靶點(diǎn)，從而阻斷miR-181a下調(diào)其靶基因發(fā)揮相應(yīng)功能。MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，胰腺癌細(xì)胞增殖能力顯著下降，轉(zhuǎn)染后24、48、72 h等3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PMI組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由此考慮miR-181a可能通過靶向作用于某種抑癌基因，抑制其表達(dá)，從而發(fā)揮提高胰腺癌細(xì)胞增殖能力的作用。當(dāng)胰腺癌細(xì)胞中miR-181a水平下調(diào)，其相關(guān)抑癌基因得到釋放并明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果證實(shí)上述猜想，miR-181a受抑制的PMI組胰腺癌細(xì)胞在不同時(shí)點(diǎn)其增殖能力均明顯下降。組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化趨勢(shì)提示PMI組的抑制率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，48 h內(nèi)抑制效果增加較為顯著，但隨后趨勢(shì)有所減緩。由此推測(cè)miR-181a inhibitor的拮抗效果隨時(shí)間的推移持續(xù)加強(qiáng)，但增速48 h后有所減緩。這一現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能與轉(zhuǎn)染的miR-181a拮抗劑濃度不夠，或者胰腺癌細(xì)胞本身存在某種代償機(jī)制，抑或miR-181a拮抗劑的轉(zhuǎn)染存在一定的時(shí)效性，難以長(zhǎng)期穩(wěn)定地在細(xì)胞中發(fā)揮作用有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入探討。

雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的作用原理是：構(gòu)建一個(gè)將靶啟動(dòng)子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報(bào)告基因質(zhì)粒，將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞系，如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則熒光素酶基因就會(huì)表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以測(cè)定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動(dòng)子片段有作用[14]。將CARF基因3’-UTR片段克隆在熒光素酶報(bào)告基因的下游，若該片段序列內(nèi)確實(shí)存在miR-181a的作用靶點(diǎn)，兩者結(jié)合可降低熒光素酶活性，否則熒光素酶活性將不受影響。而作為內(nèi)對(duì)照的海馬腎熒光報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK不受上述反應(yīng)的影響，始終能夠穩(wěn)定表達(dá)。在生物信息學(xué)靶基因預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)證實(shí)CARF基因3’-UTR是否存在miR-181a的作用靶點(diǎn)。本研究中轉(zhuǎn)染空白對(duì)照質(zhì)粒PGL3-control的Panc I A組細(xì)胞不影響熒光素酶活性。Panc I B組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGL3-CARF3’-UTR后，因Panc I胰腺癌細(xì)胞本身存在miR-181a表達(dá)，其與質(zhì)粒相互作用后導(dǎo)致熒光素酶活性有所下降。當(dāng)Panc I C組細(xì)胞加入拮抗劑miR-181a inhibitor，因細(xì)胞本身的miR-181a被抑制，熒光素酶活性明顯上升；Panc I D與Panc I E兩組細(xì)胞加入激動(dòng)劑hsa-miR-181a，提高了胰腺癌細(xì)胞中的miR-181a水平，熒光素酶活性隨之受到明顯抑制。上述研究結(jié)果表明miR-181a和CARF基因確實(shí)存在靶向關(guān)系，即CARF基因3’-UTR片段中包含miR-181a的作用靶點(diǎn)。接著還通過研究miR-181a對(duì)CARF蛋白表達(dá)水平的調(diào)控情況，進(jìn)一步證實(shí)上述靶向關(guān)系。通過轉(zhuǎn)染miR-181a激動(dòng)劑和拮抗劑改變胰腺癌細(xì)胞中miR-181a的水平，Western blot檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞組CARF蛋白表達(dá)水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)胞中miR-181a的水平與CARF蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

本研究在明確miR-181a在胰腺癌中存在顯著高表達(dá)的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)了miR-181a和CARF的靶向關(guān)系，在獲得miR-181a與CARF基因相關(guān)性的初步證據(jù)的前提下，提出“miR-181a-CARF-p53-胰腺癌”調(diào)控途徑的猜想，并從多個(gè)角度對(duì)該假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。隨著miRNA重要性的逐步體現(xiàn)，通過外源性干預(yù)措施改變惡性腫瘤細(xì)胞中各種miRNA水平，影響其相關(guān)靶基因的表達(dá)情況，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展應(yīng)該被考慮作為一個(gè)比較有前景的治療策略[15-17]。能否利用miR-181a和CARF的靶向關(guān)系尋找治療胰腺癌的新途徑，還有待于通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等相關(guān)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。