姚麗莉,陳孝倩,黃朝興
(1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 腎內(nèi)科,浙江 麗水 323000)
M型磷脂酶A2受體(M-type phospholipase A2receptor,PLA2R)是成人特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy,IMN)的主要靶抗原。BECK等[1]發(fā)現(xiàn)IMN患者血清抗-PLA2R抗體70%陽性,且從腎活檢組織洗脫出的IgG可與PLA2R抗原起反應(yīng)。檢測血清抗-PLA2R抗體現(xiàn)已成為診斷IMN的一個很有價值的非創(chuàng)傷性檢查手段。
目前檢測血清抗-PLA2R抗體的方法最常用是ELISA法,其次是間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence testing,IIFT)法。有研究[2-3]提示IIFT法的敏感度略優(yōu)于ELISA法。本研究以104例經(jīng)腎活檢診斷腎小球疾病患者為對象,分別采用IIFT法和ELISA法檢查血抗-PLA2R抗體,研究IIFT法對IMN診斷的靈敏度和特異度。
1.1 對象 收集2016年1月至2017年7月間選擇溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢診斷腎小球疾病患者共104例,其中IMN 80例,繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy,SMN)7例,非膜性腎病(membranous nephropathy,MN)17例。MN所有患者均為初次發(fā)病的病例。104例被隨機分為IIFT組40例和ELISA組64例,分別采取IIFT法和ELISA法檢測抗-PLA2R抗體,抽取清晨空腹血樣。本研究經(jīng)過溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者簽署知情同意書。
1.2 診斷標準 成人IMN的判斷標準:①年齡>16歲;②病理符合膜性腎??;③排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡等繼發(fā)性自身免疫病、乙型病毒性肝炎、腫瘤和藥物等繼發(fā)性因素。狼瘡性腎炎病理分型參照2003年由國際腎臟病學會和腎臟病理學會修訂的分類標準(ISN/RPS)[4]。乙型肝炎病毒相關(guān)腎炎(nepatitis B-associated nephritis,HBV-GN)的診斷參照國內(nèi)腎活檢病理診斷標準指導(dǎo)意見[5]。
1.3 檢驗方法
1.3.1 IIFT法測定血清抗-PLA2R抗體:試劑盒購自德國歐蒙公司,按照試劑盒的操作步驟嚴格執(zhí)行。由溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腎臟檢驗室1位專職技師于顯微鏡下觀察熒光模型判讀結(jié)果。顯微鏡下產(chǎn)生明顯高于陰性對照的特異熒光,且有鮮明可以辨認的熒光模式,判定為陽性。
1.3.2 ELISA法測定血清抗-PLA2R抗體:送檢樣本由杭州金域檢測公司檢測完成。試劑盒購自德國歐蒙公司,酶標儀測量光密度(OD值)及濃度。陽性結(jié)果判定標準:抗-PLA2R抗體濃度>14 RU/mL記錄結(jié)果為陽性。
1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料用±s表示,計數(shù)資料用頻數(shù)或百分比表示。正態(tài)計量資料組間比較用t檢驗或方差分析;計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.12組IMN患者一般情況比較 IIFT組和ELISA組IMN患者的年齡、性別、血漿白蛋白、尿蛋白定量、血脂差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),見表1。
表1 2組IMN患者一般情況比較
2.2 IIFT法檢測血清抗-PLA2R抗體 IIFT組采用IIF法檢測血清抗-PLA2R抗體40例,其中33例IMN,陽性26例,敏感度為78.8%;2例SMN(腫瘤合并MN)均陰性。設(shè)為組內(nèi)對照的非MN 5例(微小病變腎病2例,狼瘡性腎炎IV型、乙型肝炎病毒相關(guān)性系膜毛細血管性腎小球腎炎、IgA腎病各1例),其中1例狼瘡性腎炎IV型可疑陽性,其余患者均陰性。IIFT法檢測血抗-PLA2R抗體陽性的信號見圖1。
圖1 IIFT法血清抗-PLA2R抗體陽性(免疫熒光染色,×400)
2.3 ELISA法檢測血清抗-PLA2R抗體 ELISA組采用ELISA法檢測血清抗-PLA2R抗體64例,其中IMN 47例,陽性37例,敏感度為78.7%;SMN 5例(狼瘡性腎炎V型2例,慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN 1例、干燥綜合征合并MN 1例和結(jié)腸癌合并MN 1例),其中1例慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN和1例結(jié)腸癌合并MN患者血抗-PLA2R抗體陽性,其余均為陰性。設(shè)為組內(nèi)對照的非MN 12例(局灶節(jié)段性腎小球硬化4例,微小病變2例,淀粉樣病變2例,IgA腎病、系膜毛細血管性腎小球腎炎、糖尿病腎病、高血壓腎病各1例)均為陰性。
BECK等[1]采用Western blot法檢測血清抗-PLA2R抗體對IMN診斷的靈敏度為70%,特異度為100%。目前,檢測血清抗-PLA2R抗體的方法有4種:ELISA、IIFT、Western blot和時間分辨熒光分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,F(xiàn)IA),國內(nèi)可用于臨床的有證產(chǎn)品目前僅2種:ELISA法和IIFT法。Meta分析[6]顯示,采用不同檢測方法對IMN診斷總的靈敏度為65%(63%~67%),特異度為97%(97~98%);其中ELISA法集成的診斷OR(95%CI)為45.53(26.78~77.38),無異質(zhì)性,曲線下面積(AUC)為0.9348;IIFT法集成的診斷OR(95%CI)為40.77(19.00~87.50),異質(zhì)性為61.7%,AUC為0.9296。
研究[7]顯示,采用Western blot、IIFT以及ELISA法這3種方法對血清抗-PLA2R抗體的檢出率是存在一些差別的。HOFSTRA等[2]研究了117例IMN,血清中抗-PLA2R抗體的檢測陽性率在IIFT法和ELISA法分別為74%和72%,2種方法的一致性較好(94%一致,κ=0.85)。DAHNRICH等[3]對200例采用IIFT法證實的PLA2R相關(guān)性膜性腎病(PLA2R-MN)患者同時用ELASA法檢測,結(jié)果有7例陰性。在HOFS-TRA等[2]研究的117例PLA2R-MN中,5例IIFT陽性但ELISA陰性,2例IIFT陰性而ELISA陽性。管音等[8]對59例IMN采用IIFT法檢測血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為69.5%,特異度為95.2%。本研究結(jié)果顯示,IIFT法檢測IMN血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為78.8%,ELISA法檢測IMN血清抗-PLA2R抗體的靈敏度為78.7%。
在本研究結(jié)合臨床和病理確診的IMN患者中,分別有21.2%(7/33)經(jīng)IIFT法檢測和21.3%(10/47例)經(jīng)ELISA法檢測結(jié)果為陰性,可能的解釋為:①采集患者血樣時,部分患者可能正處在疾病緩解過程中,即患者可能正處于一種低水平的免疫活動狀態(tài),使體內(nèi)的抗體水平處于一種低滴度狀態(tài),使用的試劑未能檢測出其結(jié)果。HOFSTRA等[7]檢測18例IMN患者體內(nèi)的血清抗-PLA2R抗體,其中14例陽性,1例陰性,4個月后再次對陰性患者檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血清中抗-PLA2R抗體呈陽性反應(yīng)。②IMN患者除了PLA2R以外,可能還存在其他自身靶抗原,已發(fā)現(xiàn)部分抗-PLA2R抗體陰性的IMN患者體內(nèi)可以檢測到血小板反應(yīng)蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7A)的自身抗體。但HOXHA等[9]的研究顯示,THSD7A也可能是腫瘤組織釋放的抗原,由機體免疫識別后產(chǎn)生循環(huán)中相應(yīng)抗體,這些抗體可特異性結(jié)合腎小球足細胞上的THSD7A抗原形成免疫復(fù)合物導(dǎo)致MN。③抗-PLA2R抗體的檢測結(jié)果受轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)靶抗原的構(gòu)象和表達水平的影響,造成抗體檢測結(jié)果的誤差。
HOFSTRA等[2]研究了82例PLA2R-MN,血清抗-PLA2R抗體滴度與基線尿蛋白水平顯著相關(guān)(P=0.02),高抗體滴度患者的自然緩解率明顯較低(最低滴度為38%,最高滴度為4%;P<0.01)。本研究2組IMN的尿蛋白定量和血漿白蛋白水平均無明顯差別,可基本排除疾病嚴重程度對不同方法檢測抗-PLA2R抗體敏感度的影響。
鑒于檢測血清抗-PLA2R抗體對IMN診斷具有高度特異性,一般認為血清抗-PLA2R抗體陽性診斷IMN幾乎是不用懷疑的。在本研究中,1例直腸癌合并膜性腎病患者抗-PLA2R抗體陽性,該例腎活檢組織免疫熒光以IgG4為主,在直腸癌切除術(shù)后5月腎病仍未緩解,提示該例可能為腫瘤合并IMN。
另1例ELISA法檢測血清抗-PLA2R抗體陽性為慢性乙型病毒性肝炎合并不典型MN,該患者乙肝大三陽,HBV-DNA陽性,腎活檢免疫熒光IgG4為主,腎組織HBsAg和HBcAg陰性;電鏡下伴副系膜區(qū)電子致密物。該例雖然尚不能確診為乙肝病毒相關(guān)性MN,也不能完全排除之。此外,ELISA組12例非MN均陰性,本研究ELISA法的特異度為94.1%(16/17例)。
IIFT組的2例SMN檢測血清抗-PLA2R抗體均為陰性,但組內(nèi)對照5例中有1例狼瘡性腎炎IV型(病理結(jié)果為彌漫增生型腎小球腎炎,結(jié)合電鏡已排除合并狼瘡性腎炎V型)為可疑陽性,推測這可能是由抗核抗體引起的。一項涉及SMN患者抗-PLA2R抗體的研究[10]顯示,5%的V型狼瘡性腎炎可檢測到該抗體。本研究IIFT法的特異度為85.7%(6/7),特異度偏低可能與組內(nèi)SMN及對照的例數(shù)較少有關(guān)。
在成人IMN的診斷上,IIFT法檢測血清抗-PLA2R抗體的靈敏性和特異度與ELISA法大致相當,這2種方法對診斷IMN均具有很好的實用價值。本研究尚存在一些局限性,如未在同一例患者同時進行2種方法檢測、未檢查腎組織內(nèi)PLA2R及入組的SMN患者例數(shù)不夠多等,今后有待擴大樣本量、結(jié)合2種方法及腎組織內(nèi)PLA2R檢查進一步研究。