沈新升，陳鷗，賴憲良，蘇嘉

（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325000）

骨缺損是臨床治療中常見(jiàn)的難題，組織工程學(xué)細(xì)胞經(jīng)分化后提供分化的成骨細(xì)胞[1-3]，這些細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的生理功能，是目前研究的熱點(diǎn)。但這些誘導(dǎo)的細(xì)胞隨著分化增殖的代數(shù)增多，表現(xiàn)出衰老的跡象，不能很好地維持自身的功能，給臨床轉(zhuǎn)化帶來(lái)了限制。誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，IPS細(xì)胞）是能無(wú)限制定向分化為各種間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的種子細(xì)胞[4]。目前已有將IPS細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的報(bào)道[5-7]。然而IPS細(xì)胞在低氧環(huán)境中的生理狀態(tài)及能否發(fā)揮生理作用目前尚不清楚，有報(bào)道認(rèn)為紅景天苷對(duì)細(xì)胞在低氧環(huán)境中有保護(hù)作用[8]。本研究對(duì)IPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分成正常組、低氧組、紅景天苷預(yù)處理組，探討紅景天苷對(duì)IPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞在低氧環(huán)境的生理狀態(tài)的保護(hù)作用以及可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞購(gòu)自上海典藏細(xì)胞庫(kù)，293T細(xì)胞購(gòu)自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司，BALB/c型4周齡小鼠購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXY（浙）2010-0150，實(shí)驗(yàn)在溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF4的慢病毒質(zhì)粒由廣州四和公司包裝， II型膠原蛋白酶和胰酶（美國(guó)Sigma公司），胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、100×青鏈霉素（美國(guó)Gibco公司），抗壞血酸、甘油磷酸、地塞米松（美國(guó)Sigma公司），β-actin抗體（美國(guó)Proteintech集團(tuán)），RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白含量測(cè)定試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、DAB發(fā)光液、TBST液（上海碧云天公司），F(xiàn)ITC/PI試劑盒（美國(guó)Sigma公司）。紅景天苷（純度＞99%，中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia induced factor-1，HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（美國(guó)Sigma公司），聚凝胺溶液（上海碧云天公司），Defined FBS（美國(guó)Gibco公司）。內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR檢測(cè)試劑盒由廣州四和公司提供。

1.2 成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法 將BALB/c型小鼠夾頭處死，剝?nèi)∑つw，剔去皮下組織、血管和血跡，含1%青鏈霉素的PBS 30 mL沖洗3次，每次30 s。采用組織塊法，將皮膚剪成0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的組織塊，接種于75 mL培養(yǎng)瓶中，2 mg/mL II型膠原蛋白酶消化，于5% CO2、21% O2、37 ℃條件下過(guò)夜，PBS液清洗后，0.25%胰酶消化，用含胎牛血清的DMEM/F12清洗，1500×g離心10 min，取上清液加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中。每2～3 d更換DMEM/F12培養(yǎng)液1次。等細(xì)胞爬滿培養(yǎng)瓶底部約占80%時(shí)，胰酶消化傳代。收集第三代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）滋養(yǎng)層制備方法 取MEF，0.25%胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12，按1×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中。爬滿80%瓶底后，加入4 mL 10 μg/mL的絲裂霉素C處理MEF細(xì)胞2 h，棄掉絲裂霉素C，PBS清洗2次，用0.1%基質(zhì)膠預(yù)處理，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。

1.4 IPS細(xì)胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法 采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將含Oct4、SOX2、C-MYC和KLF44種cDNA的慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，提取病毒上清液。取等體積病毒上清液和4 mg/L聚凝胺溶液混合，替換成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，5% CO2、21% O2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育6 h。將誘導(dǎo)的細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于失活的MEF上48 h后，培養(yǎng)基改換成Defined FBS，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每72 h傳代一次，取第三代細(xì)胞，按照說(shuō)明書進(jìn)行小鼠成纖維細(xì)胞行內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的QT-PCR檢測(cè)。

1.5 IPS細(xì)胞誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞方法 取第三代培養(yǎng)的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)離心機(jī)分離，然后用0．25%胰蛋白酶處理成單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有明膠涂層的培養(yǎng)皿上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液為成骨分化培養(yǎng)液，其包含50 μg/mL抗壞血酸，lO nmol/L地塞米松，5 mmol/L 3-甘油磷酸。培養(yǎng)液每3 d換1次，細(xì)胞在第21天時(shí)按照實(shí)驗(yàn)試劑說(shuō)明書進(jìn)行茜素紅染色。

1.6 分組方法 誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞分成3組（對(duì)照組、低氧組、紅景天苷預(yù)處理組）。對(duì)照組于5% CO2、21% O2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。低氧組于5% CO2、0.5% O2、37 ℃條件下培養(yǎng)12 h。紅景天苷預(yù)處理組于5% CO2、5% O2、37 ℃條件下在含1 mg/L的紅景天苷培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至5% CO2、0.5%O2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 h（其余條件不變）。

1.7 Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 用胰酶+EDTA混合液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，按試劑盒操作說(shuō)明書操作，計(jì)算FITC單染（Q3）與-FITC/PI雙染（Q2）的陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)之和作為該樣品細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)VEGF和HIF-1α表達(dá)量 分組提取細(xì)胞總蛋白，按照VEGF和HIF-1α的Western blot檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)試劑盒操作說(shuō)明書步驟操作，運(yùn)用Bio-Rad公司的Quantity One軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IPS細(xì)胞內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2表達(dá)結(jié)果 重編程的細(xì)胞的干細(xì)胞標(biāo)志物內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于在小鼠成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 IPS細(xì)胞內(nèi)源性基因Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2在IPS細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量

2.2 IPS細(xì)胞成骨定向分化后的細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果 IPS細(xì)胞成骨定向分化后的細(xì)胞茜素紅染色表達(dá)陽(yáng)性，見(jiàn)圖2。

圖2 IPS細(xì)胞成骨定向分化后細(xì)胞染色結(jié)果（茜素紅染色，×200）

2.3 3組誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡率比較 正常組細(xì)胞組凋亡率為0.88%±0.18%，紅景天苷預(yù)處理組為35.65%±3.92%，低氧組凋亡率為95.20%±1.03%。正常組和紅景天苷預(yù)處理組凋亡率低于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；正常組凋亡率低于紅景天苷預(yù)處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖33組誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞凋亡率Annexin V-FITC/PI檢測(cè)分析圖

2.4 3組誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞VEGF和HIF-1α蛋白水平比較 紅景天苷預(yù)處理組VEGF蛋白表達(dá)量高于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。紅景天苷預(yù)處理組HIF-1α蛋白表達(dá)量高于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組的VEGF蛋白表達(dá)量高于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組的HIF-1α蛋白表達(dá)量高于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，IPS細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)誘導(dǎo)后，能誘導(dǎo)出符合成骨細(xì)胞生物學(xué)活性和表型的細(xì)胞。OKAMOTO等[9]用2-硫基乙醇和抗白血病因子將IPS細(xì)胞定向分化成成骨細(xì)胞。錢浩等[10]用抗壞血酸、地塞米松和3-甘油磷酸等將IPS細(xì)胞定向分化成成骨細(xì)胞。茜素紅染色是成骨細(xì)胞的特異性染色檢測(cè)。本研究中重編程的細(xì)胞的Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2的表達(dá)明顯高于成纖維細(xì)胞的表達(dá)，說(shuō)明重編程的細(xì)胞具有IPS細(xì)胞的特征。而重編程的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后，茜素紅染色陽(yáng)性，表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞成骨分化程度高。因此可以認(rèn)為重編程的IPS細(xì)胞能定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。

圖43組誘導(dǎo)后的成骨細(xì)胞HIF-1α和VEGF的蛋白表達(dá)

種子細(xì)胞在低氧環(huán)境中是否可以存活，目前仍存在著爭(zhēng)論。GENG[11]將MSCs注射到發(fā)生心肌梗死小鼠的心室，4 d后99%的MSCs死亡，表明缺血缺氧環(huán)境中細(xì)胞存活困難。但FOLLMAR等[12]發(fā)現(xiàn)在0.1%O2（極度低氧）下兔來(lái)源的干細(xì)胞死亡增多，但在有限的氧濃度下細(xì)胞依舊可以存活。給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)，提高細(xì)胞的抗凋亡能力，有助于提高低氧環(huán)境中細(xì)胞的生存能力。

HIF-1是缺氧條件下傳遞缺氧信號(hào)、介導(dǎo)缺氧效應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與缺氧相關(guān)反應(yīng)元件結(jié)合，刺激下游相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)血管生成。HIF-1的結(jié)構(gòu)由HIF-1α和HIF-1β組成，其中HIF-1α發(fā)揮主要的生物學(xué)活性。紅景天苷是從中藥紅景天中提取的化學(xué)成分，在減輕缺氧癥狀和抗氧化方面具有重要作用[13]。李慶勇等[14]發(fā)現(xiàn)在低氧情況下，組織的HIF-1α表達(dá)會(huì)增加，然而在本研究中，低氧組的誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞表達(dá)HIF-1α低于正常組。這可能是由實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中低氧的濃度不同，同時(shí)HIF-1α極不穩(wěn)定，容易丟失等情況引起。在本研究中，紅景天苷預(yù)處理組的HIF-1α表達(dá)高于低氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明紅景天苷能提高細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)，并對(duì)HIF-1α起到穩(wěn)定的作用，與STEGEN等[15]的研究結(jié)果一致。

VEGF是HIF-1α的下游基因，HIF-1α的增加能促進(jìn)VEGF的表達(dá)。在本研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞在紅景天苷預(yù)處理組與低氧組比較時(shí)，VEGF表達(dá)升高，表明紅景天苷通過(guò)提高誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，間接促進(jìn)VEGF的表達(dá)。有研究[16-17]認(rèn)為VEGF可以抑制細(xì)胞的凋亡，改善細(xì)胞的狀態(tài)。本研究Annexin V-FITC/PI凋亡率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅景天苷預(yù)處理組的成骨細(xì)胞凋亡率明顯低于低氧組。KLUCK等[18]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞凋亡早期，給予刺激因素可以挽救細(xì)胞，使其恢復(fù)正常的生理。因此，本研究認(rèn)為用紅景天苷預(yù)處理的方法可以提高低氧情況下誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞的生理狀態(tài)，對(duì)誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能為紅景天苷通過(guò)提高誘導(dǎo)后成骨細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，間接促進(jìn)VEGF的表達(dá)，發(fā)揮抑制誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡的作用。