田靜，侯志東，任湘鵬

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)室中心，浙江 溫州 325027）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是第二大常見的進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢不穩(wěn)等運(yùn)動(dòng)癥狀；典型的病理特征為中腦黑質(zhì)致密區(qū)（substantia nigra pars compacta，SNpc）多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失，殘存的DA能神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)路易小體（Lewy bodies，LBs），即α-突觸核蛋白（α-synuclein，αS）包涵體。目前PD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，現(xiàn)有的臨床藥物只能緩解PD癥狀，不能有效地阻斷或延緩PD病理進(jìn)程，其中一個(gè)重要的原因是缺乏闡明PD發(fā)病機(jī)制的理想動(dòng)物模型。近年來學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為αS異常聚集和病理傳播是PD發(fā)病的核心機(jī)制[1]，具體表現(xiàn)為：αS編碼基因的遺傳多態(tài)性（如A53T突變）是導(dǎo)致家族性PD的重要原因[2]，而錯(cuò)誤折疊的αS聚集體是PD病理標(biāo)志物L(fēng)Bs的主要成分[3]，因此基于αS的PD動(dòng)物模型成為研究熱點(diǎn)[4]。采用腦內(nèi)注射重組αS原纖維，模擬胞外αS在神經(jīng)元之間傳播擴(kuò)散的朊病毒樣特性而建立的αS原纖維PD模型為研究PD的病理機(jī)制提供了嶄新的動(dòng)物模型[5]。將錯(cuò)構(gòu)的αS原纖維直接注射至正常小鼠紋狀體腦區(qū)，發(fā)現(xiàn)αS可由紋狀體擴(kuò)散到中腦SNpc區(qū)，導(dǎo)致DA能神經(jīng)元變性丟失、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知損傷等PD病理特征[6]。然而，αS原纖維在中腦SNpc區(qū)直接導(dǎo)致的DA能神經(jīng)元病理變化及行為學(xué)表型尚不清楚。本研究利用小鼠腦內(nèi)SNpc定位注射A53T突變型αS（A53T αS）原纖維的方法，建立PD小鼠模型，檢測模型小鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知行為學(xué)表型，并采用免疫組織化學(xué)染色法觀察模型小鼠腦內(nèi)典型的病理特征，為進(jìn)一步探索αS在PD中的病理機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：重組A53T αS蛋白[純度＞95%，輝源生物科技（上海）有限公司]，抗磷酸化α-突觸核蛋白（phosphorylated α-synuclein，pSyn）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）及小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA-1）單克隆抗體購自美國Abcam公司，ABC免疫組織化學(xué)檢測及DAB試劑盒購自德國Vector公司，其余生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康10～12周齡雄性C57BL/6小鼠20只，體質(zhì)量22～26 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0008，在溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)。室溫控制在（24±2）℃，濕度控制在（60±2）%，日光燈照明250～300 lux，擁有自動(dòng)定時(shí)裝置的12h/12 h光照/黑暗環(huán)境。給予每籠小鼠充足的水糧，適當(dāng)活動(dòng)空間，小鼠能夠自由進(jìn)水、攝食。所有動(dòng)物的使用均遵照國家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)于1988年頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并通過溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物使用倫理委員會(huì)審核。

1.1.3 主要設(shè)備：腦立體定位儀（美國KOPF公司），手術(shù)顯微鏡及正置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），手術(shù)器械（深圳瑞沃德公司），微量注射器（美國Hamilton公司），超低溫冰箱及冷凍離心機(jī)（美國Thermo公司），冰凍切片機(jī)（德國Leica公司），曠場實(shí)驗(yàn)箱及Y迷宮（上海優(yōu)耳儀器科技有限公司），行為學(xué)視頻分析軟件（荷蘭Noldus公司），精密電子天平（Satorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），旋渦混合器（XW-80，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），超純水器（UPWS-1-20T，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司），pH計(jì)（Delta 320，上海峰至儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 A53T αS原纖維制備及處理[7]：重組A53T αS用無菌PBS稀釋到5 mg/mL，37 ℃下以1000 r/min的轉(zhuǎn)速持續(xù)震蕩孵育，使A53T αS蛋白組裝成原纖維。將A53T αS稀釋至1 mg/mL，分裝100 μL/管，-80 ℃保存?zhèn)溆?。低溫下用超聲破碎儀短暫超聲處理后用于腦立體定位注射。

1.2.2 動(dòng)物分組：將20只雄性健康成年C57BL/6小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，模型組小鼠注射A53T αS原纖維，對照組注射無菌PBS。小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

1.2.3 A53T αS原纖維PD小鼠模型的建立[7]：小鼠進(jìn)行SNpc腦區(qū)的單次雙側(cè)立體定位注射造模。參照《小鼠腦立體定位圖譜》，SNpc腦區(qū)注射坐標(biāo)定位為：前囟后（AP）-3.16 mm，旁開（ML）±1.25 mm，深度（DV）-4.00 mm。小鼠麻醉、固定，剪開頭皮暴露術(shù)野，進(jìn)行SNpc定位及鉆孔，最后使用Hamilton微量注射器于SNpc坐標(biāo)緩慢雙側(cè)注射5 μg A53T αS原纖維及無菌PBS。注射結(jié)束后，留針5 min后緩慢拔出針頭，并于顱骨表面撒少許青霉素粉末防止感染。術(shù)后將小鼠置于恒溫恢復(fù)器，待小鼠蘇醒后移至鼠籠常規(guī)飼養(yǎng)。造模時(shí)間為3個(gè)月。

1.2.4 行為學(xué)檢測[6-7]：行為學(xué)試驗(yàn)前將小鼠提前運(yùn)至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室專用籠架適應(yīng)3 h左右，以減輕動(dòng)物應(yīng)激和緊張情緒。曠場試驗(yàn)中，將小鼠放于曠場實(shí)驗(yàn)箱（40 cm×40 cm）中央，箱子的上方安裝有與行為學(xué)記錄分析系統(tǒng)相連接的攝像機(jī)，記錄小鼠在實(shí)驗(yàn)箱中的運(yùn)動(dòng)軌跡。采集分析小鼠自由探索5 min內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離，反映小鼠的運(yùn)動(dòng)能力。懸掛試驗(yàn)使用一個(gè)鋪有柔軟墊料的大鼠籠和籠蓋，固定籠蓋，高度定為25 cm以上。把小鼠放在籠蓋上，使其爪抓住籠蓋桿，翻轉(zhuǎn)籠蓋，使其四爪抓住蓋桿倒掛，迅速開始計(jì)時(shí)；小鼠從桿上掉下，結(jié)束計(jì)時(shí)，記錄懸掛持續(xù)時(shí)間，反映小鼠的肌力和平衡協(xié)調(diào)能力。每只小鼠重復(fù)3次，取最大值作為小鼠的測試結(jié)果，試驗(yàn)時(shí)間不超過10 min。Y迷宮試驗(yàn)中，標(biāo)記Y迷宮三個(gè)臂分別為A、B、C，將小鼠置于A臂末端，讓小鼠在Y迷宮內(nèi)自由探索5 min。記錄小鼠依次進(jìn)臂的順序，統(tǒng)計(jì)正確的輪替次數(shù)（依次進(jìn)入三個(gè)不同的臂）以及總的輪替次數(shù)，兩者比值即為自發(fā)交替正確率，作為評價(jià)小鼠工作記憶的指標(biāo)。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色[7]：造模后的小鼠經(jīng)過灌注取腦、固定及脫水等一系列預(yù)處理后進(jìn)行SNpc區(qū)冠狀位冰凍切片，切片厚度30 μm，存放于4 ℃冰箱的冰凍保存液中備用。腦片室溫復(fù)溫漂洗，免疫染色抗體稀釋液1∶1000稀釋一抗（pSyn、TH及IBA-1抗體），室溫慢搖孵育過夜。用免疫染色抗體稀釋液1∶1000稀釋生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。用ABC復(fù)合物室溫孵育1 h后將腦片黏附到載玻片上，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色溶液，顯微鏡下觀察，控制染色時(shí)間5～20 min。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核45 s后，切片室溫下晾干、梯度脫水、中性樹膠封片晾干后在顯微鏡下拍攝。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Image J軟件測量SNpc腦片中免疫組織化學(xué)染色圖片包含陽性信號(hào)的細(xì)胞百分比或陽性細(xì)胞數(shù)量，每只小鼠挑選3張腦片（前中后各一張），求其平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以±s的形式表示。方差齊性檢驗(yàn)采用Levene檢驗(yàn)，2組樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A53T αS原纖維PD小鼠模型的行為學(xué)表型 曠場試驗(yàn)中，模型組小鼠5 min內(nèi)的總運(yùn)動(dòng)距離較對照組小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明模型組小鼠尚未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能的改變。懸掛試驗(yàn)顯示模型組小鼠四爪抓桿持續(xù)時(shí)間較對照組顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示模型組小鼠肌力和平衡協(xié)調(diào)能力下降。Y迷宮檢測表明模型組小鼠的自發(fā)轉(zhuǎn)換正確率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明模型組小鼠未出現(xiàn)工作記憶認(rèn)知功能的改變。見表1。

表1 A53TαS原纖維PD小鼠模型的行為學(xué)表型（每組n=10，±s）

表1 A53TαS原纖維PD小鼠模型的行為學(xué)表型（每組n=10，±s）

組別 曠場試驗(yàn)總運(yùn)動(dòng)距離（cm） 懸掛試驗(yàn)四爪抓桿持續(xù)時(shí)間（s） Y迷宮實(shí)驗(yàn)自發(fā)轉(zhuǎn)換正確率（%）對照組 4221.8±339.8 315.0±46.6 66.9±1.7模型組 4052.7±169.1 194.9±26.0 60.6±2.7 t 0.446 2.250 1.982 P 0.661 0.037 0.063

2.2 A53T αS原纖維PD小鼠模型的LBs病理分析

本研究以絲氨酸129位磷酸化的pSyn作為評估LBs包涵體的標(biāo)記物。免疫組織化學(xué)染色顯示在SNpc腦區(qū)注射位點(diǎn)附近可以觀察到顯著的LBs包涵體病理改變（見圖1）。模型組小鼠SNpc腦區(qū)pSyn包涵體陽性的SNpc區(qū)細(xì)胞百分比為（35.60±3.93）%，顯著高于對照組的（4.22±0.27）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.964，P＜0.001）。

2.3 A53T αS原纖維PD小鼠模型的DA能神經(jīng)元定量分析 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，SNpc腦區(qū)注射A53T αS導(dǎo)致TH陽性神經(jīng)元的丟失（見圖2），模型組小鼠SNpc腦片中可清晰定量的TH陽性神經(jīng)元數(shù)量為（59.78±4.23）個(gè)，顯著低于對照組的（87.13±3.71）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.807，P＜0.001）。

圖1 pSyn免疫組織化學(xué)染色圖

圖2 TH免疫組織化學(xué)染色圖（×10）

2.4 A53T αS原纖維PD小鼠模型的神經(jīng)炎癥分析 IBA-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，SNpc腦區(qū)注射A53T αS導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大、突起變短、細(xì)胞形態(tài)呈圓形或桿狀（見圖3）。模型組小鼠活化小膠質(zhì)細(xì)胞相對數(shù)量（1.13±0.17）為對照組（2.78±0.23）的2.78倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.685，P＜0.001），提示模型組小鼠SNpc腦區(qū)存在過度的神經(jīng)炎癥。

3 討論

以αS的異常聚集和擴(kuò)散為分子標(biāo)志的LBs腦內(nèi)傳播是PD的病理標(biāo)志，為解釋PD的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀提供了較好的理論模型，也為建立基于αS的PD動(dòng)物模型提供了理論基礎(chǔ)[8]?，F(xiàn)有的基于αS的PD動(dòng)物模型中，αS轉(zhuǎn)基因小鼠PD模型可以較好地模擬腦內(nèi)αS聚集及LBs傳播擴(kuò)散的病理進(jìn)程，但大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中未發(fā)現(xiàn)SNpc區(qū)DA能神經(jīng)元丟失這一典型病理標(biāo)志[9]。重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的αS過表達(dá)PD模型存在病毒載體純化要求高的難題，且在模擬PD病理進(jìn)展上存在缺陷[10]?；讦罶原纖維的PD病理傳播模型較好地克服了以上2種模型的不足，可全面模擬出PD主要病理特征。研究人員可通過向健康動(dòng)物腦內(nèi)直接注射包含αS病理的PD患者尸檢或老齡αS轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織勻漿[11]，或?qū)Ⅲw外重組表達(dá)并純化的αS蛋白制備成原纖維后直接腦內(nèi)注射造模[6]。這種基于αS原纖維的PD模型的原理是利用錯(cuò)誤折疊的αS可在細(xì)胞間傳播，并觸發(fā)正常內(nèi)源性αS由α螺旋向β折疊的構(gòu)象轉(zhuǎn)變的特性，最終導(dǎo)致PD進(jìn)行性神經(jīng)退行性變的啟動(dòng)和病理進(jìn)展[12]。因此，基于αS原纖維的PD模型在研究αS病理傳播機(jī)制中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

圖3 IBA-1免疫組織化學(xué)染色圖

本實(shí)驗(yàn)利用小鼠腦內(nèi)SNpc定位注射突變型A53T αS原纖維的方法，成功地建立了αS原纖維PD小鼠模型，同時(shí)模擬出LBs包涵體、DA能神經(jīng)元丟失及神經(jīng)炎癥三大PD病理特征。行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，模型組小鼠表現(xiàn)出顯著的肌力減弱及平衡力下降。LUK等[6]在小鼠的背側(cè)紋狀體區(qū)注射αS原纖維，造模30 d時(shí)通過懸掛實(shí)驗(yàn)就能檢測到實(shí)驗(yàn)組小鼠的肌力及協(xié)調(diào)能力減弱。本實(shí)驗(yàn)中模型小鼠尚未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能的顯著下降，這與LUK等[6]的研究結(jié)果不一致，推測可能是因?yàn)榧y狀體DA水平尚未明顯下降（紋狀體腦區(qū)TH免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，DA能神經(jīng)元末梢尚未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，數(shù)據(jù)未顯示），也可能是本實(shí)驗(yàn)中的曠場試驗(yàn)檢測不夠靈敏，需要加大樣本量。另外，本研究團(tuán)隊(duì)曾在前期報(bào)道過在海馬區(qū)注射A53T αS原纖維可導(dǎo)致小鼠工作記憶的受損[7]，這與本研究結(jié)果不一致，原因可能是A53T αS原纖維直接注射到中腦SNpc區(qū)3個(gè)月時(shí)間尚不足以擴(kuò)散到海馬和皮層等與認(rèn)知密切相關(guān)的腦區(qū)，或雖有少量擴(kuò)散，但不足以影響到其神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能的完整性。因此，αS原纖維注射到不同的腦區(qū)可能出現(xiàn)αS病理的傳播差異，從而導(dǎo)致不同的行為學(xué)表型，說明了αS病理和行為學(xué)表型之間的密切聯(lián)系。

PD患者的LBs中有90%以上為絲氨酸129位磷酸化的αS陽性包涵體，而在正常人的腦內(nèi)僅有4%的αS有此位點(diǎn)的磷酸化[13]，因此，本研究以絲氨酸129位磷酸化的pSyn作為檢測LBs包涵體的病理標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)中A53T αS原纖維誘導(dǎo)的LBs包涵體的形態(tài)呈多樣性變化，有典型的強(qiáng)免疫活性的球形包涵體形式、紡錘絲樣神經(jīng)突形式以及大量規(guī)則不一的微粒狀形式，這與KUUSISTO等[14]的研究結(jié)論一致，反映了A53T αS聚集程度的不同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)直接在SNpc區(qū)注射A53T αS原纖維3個(gè)月可導(dǎo)致約30%的DA能神經(jīng)元丟失，進(jìn)一步證實(shí)了LBs和DA能神經(jīng)元變性之間的因果聯(lián)系。LUK等[6]發(fā)現(xiàn)紋狀體區(qū)注射αS原纖維3個(gè)月和6個(gè)月后，αS病理可擴(kuò)散到SNpc區(qū)，并分別導(dǎo)致DA能神經(jīng)元死亡15%和35%；且發(fā)現(xiàn)αS原纖維誘導(dǎo)的LBs包涵體出現(xiàn)在DA能神經(jīng)元死亡之前，同樣證實(shí)了兩者的因果關(guān)系。不同之處在于，本實(shí)驗(yàn)采用的是比αS原纖維毒性更強(qiáng)的突變型A53T αS原纖維，且直接注射在SNpc區(qū)，因而能夠更快地導(dǎo)致更多的DA能神經(jīng)元死亡。此外，研究表明PD尸檢腦內(nèi)有明顯的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，主要包括小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活及形態(tài)功能改變等；和SACINO等[15]的研究結(jié)果一致，我們同樣發(fā)現(xiàn)A53T αS原纖維導(dǎo)致了以小膠質(zhì)細(xì)胞活化為特征的神經(jīng)炎癥的過度激活。

總之，本實(shí)驗(yàn)利用SNpc區(qū)定位注射的方法建立了基于A53T αS原纖維的PD小鼠模型，證實(shí)了該模型可較為全面地模擬PD表型和病理特征，為進(jìn)一步研究PD的病理機(jī)制及靶向αS的藥物篩選提供前期基礎(chǔ)。但是，A53T αS原纖維對DA能神經(jīng)元毒性的分子機(jī)制，以及A53T αS在DA能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的吸收、分泌和擴(kuò)散機(jī)制尚需深入研究。