姜月紅 李曉林 孫 健 閆 莉 王 彤 尤玉紅 金 薇 王 鋒 張 超

黑龍江省醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江哈爾濱 150000

念珠菌[1]是一種腐物寄生菌，廣泛存在于自然界。是人體正常菌群之一，平時(shí)主要生存于人體的口腔、皮膚、黏膜、消化道、陰道及其他臟器中。正常人群白色的帶菌率可高達(dá)40%；從陰道粘膜分離出來的念珠菌85% ～ 90%為白色。以白色的致病性最強(qiáng)。近年來真菌感染的發(fā)病率呈現(xiàn)了逐年上升的趨勢(shì)，以往我們都是通過菌落培養(yǎng)、病理組織等方法進(jìn)行診斷，但是由于此過程耗時(shí)長且敏感度較低，易受外界因素的干擾，目前臨床中較少應(yīng)用。有關(guān)文獻(xiàn)曾報(bào)道，（1，3）-β-D葡聚糖是真菌胞壁的重要組成部分，其指標(biāo)的高低可能同真菌感染的嚴(yán)重程度有關(guān)[2]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了大鼠作為感染白色念珠菌病的模型，分析血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同藥物療效間的聯(lián)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠 于2017年9月～2018年5月間選擇健康的Wistar大鼠共計(jì)90只，小鼠均為6～9周齡，雌雄均可入組，體重180～220g。供應(yīng)商為長沙市天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011]。將大鼠隨機(jī)分為治療組、模型組及對(duì)照組，每組各30只。治療組大鼠雌性16只，雄性14只，平均月齡（7.03±2.31）周，平均體重（200.45±23.31）g；模型組大鼠雌性15只，雄性15只，平均月齡（6.97±2.21）周，平均體重（198.71±22.27）g；對(duì)照組大鼠雌性14只，雄性16只，平均月齡（7.12±2.40）周，平均體重（201.02±21.98）g。各組大鼠間月齡、雌雄及體重等一般資料情況間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。大鼠購回后均經(jīng)過7d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，減少應(yīng)激反應(yīng)的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)中大鼠均按常規(guī)飼養(yǎng)方式喂養(yǎng)。

1.1.2 念珠菌菌種 實(shí)驗(yàn)用的白色念珠菌菌種選用杭州微球生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的白色念珠菌[菌種編號(hào)CMCC（F）98001]。使用時(shí)用取規(guī)定的稀釋液加到凍干菌種球中，混合震蕩1min，使其充分溶解。并植于培養(yǎng)基上培養(yǎng)36h，將培養(yǎng)后的菌種經(jīng)生理鹽水稀釋后準(zhǔn)備使用。

1.1.3 儀器與試劑 氟康唑選用廣東逸舒制藥股份有限公司生產(chǎn)的氟康唑膠囊（H20066085），規(guī)格150mg/粒；微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)選用北京金山川科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的MB-80E型微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)[京藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第2400896號(hào)]；真菌檢測(cè)試劑盒選用北京金山川科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的GKT-5M型試劑盒[國食藥監(jiān)械（試）字2016第3080005號(hào)]；培養(yǎng)基選擇沙包氏瓊脂培養(yǎng)基[粵食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2010第2400119號(hào)]；保溫箱選用上海印溪儀器儀表有限公司生產(chǎn)的LRH-150SDP 型綜合穩(wěn)定性保溫試驗(yàn)箱。

1.2 方法

1.2.1 模型處理 對(duì)治療組和模型組大鼠尾靜脈注射濃度7×105的制備好的白色念珠菌懸液2mL，治療組在模型建立成功后24h經(jīng)口灌入氟康唑10mg/只，10mg氟康唑用2mL生理鹽水制成混懸液灌入，每日兩次，分別于用藥前、用藥后1、3及7d抽取靜脈血無菌分離血漿并取活腎組織留檢。模型組在相同時(shí)間用2mL生理鹽水經(jīng)口灌入，取樣時(shí)間及方法同治療組。對(duì)照組取樣時(shí)間同治療組及模型組。

1.2.2 模型處理[3]取已經(jīng)無菌肝素鈉處理過的靜脈一次性采血管抽取大鼠靜脈血2mL，滅菌密封后置于離心機(jī)中以2000rPm速率離心60s后立即置于冰水浴中，即獲得待測(cè)血漿。取待測(cè)血漿0.5mL置于反應(yīng)劑中，置于MB-80E型微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)反應(yīng)后的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出（1，3）-β-D葡聚糖水平。

在指定時(shí)間處死對(duì)應(yīng)大鼠取雙腎，制成無菌的勻漿，經(jīng)10mL生理鹽水稀釋后取上層清液10μL接種在培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，24h后測(cè)定菌落計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究資料錄入SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布，采用方差分析法，組間采用q檢驗(yàn)分析；若不服從正態(tài)分布則運(yùn)用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌落計(jì)數(shù)情況

各組間首先進(jìn)行方差分析，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各項(xiàng)目，分別與對(duì)照組進(jìn)行組間兩兩比較，用藥前顯示模型組的念珠菌菌數(shù)明顯高于對(duì)照組（q=9.916，P＜0.05），治療組的念珠菌菌數(shù)明顯高于對(duì)照組（q=10.731，P＜0.05），說明建模成功，可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；治療組念珠菌菌數(shù)隨治療天數(shù)增加逐漸降低，且在用藥后3d開始同模型組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=-8.432；q=-10.118；q=-9.992，P＜0.05）。見表1。

表1 不同時(shí)間菌落計(jì)數(shù)情況比較（±s，cFu）

表1 不同時(shí)間菌落計(jì)數(shù)情況比較（±s，cFu）

組別 用藥前 用藥后1d 用藥后3d 用藥后5d 用藥后7d對(duì)照組 0.17±0.25 0.14±0.19 0.21±0.25 0.20±0.31 0.18±0.19模型組 263.41±137.06 289.45±173.96 254.70±182.42 189.89±121.02 107.32±97.32治療組 271.21±154.91 195.12±140.12 58.19±57.19 7.81±6.01 2.01±1.92 F 14.665 15.876 13.246 16.554 16.348 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平

各組間首先進(jìn)行方差分析，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各項(xiàng)目，分別與對(duì)照組進(jìn)行組間兩兩比較，用藥前顯示模型組的血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平明顯高于對(duì)照組（q=11.682，P＜0.05），治療組的血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平明顯高于對(duì)照組（q=11.798，P ＜ 0.05），說明（1，3）-β-D 葡聚糖水平升高反映了真菌感染的存在；治療組（1，3）-β-D葡聚糖水平隨治療天數(shù)增加逐漸降低，且在用藥后3d開始同模型組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=-9.563；q=-9.119；q=-11.928，P ＜ 0.05）。見表 2。

表2 不同時(shí)間（1，3）-β-D葡聚糖水平情況比較（±s，mmol/L）

表2 不同時(shí)間（1，3）-β-D葡聚糖水平情況比較（±s，mmol/L）

組別 用藥前 用藥后1d 用藥后3d 用藥后5d 用藥后7d對(duì)照組 10.03±7.58 9.79±8.13 10.42±9.37 11.68±8.21 9.12±7.34模型組 4412.21±3190.31 4769.12±3365.28 4012.43±3013.94 3114.54±2832.27 592.23±394.21治療組 4230.45±3464.20 2630.42±2732.35 739.29±693.04 25.19±17.88 9.29±6.00 F 16.332 21.379 28.546 19.875 21.034 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落計(jì)數(shù)相關(guān)性情況

治療組用藥前、用藥后 1、3及 7d血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落計(jì)數(shù)具有相關(guān)性（P ＜ 0.05），模型組以上各時(shí)間血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落計(jì)數(shù)也具有相關(guān)性（P＜0.05）。以上結(jié)果說明血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映念珠菌菌落計(jì)數(shù)情況，可以間接說明藥物的療效情況。見表3。

表3 血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落計(jì)數(shù)相關(guān)性情況

3 討論

有文獻(xiàn)指出[4-5]，白念珠菌感染，首先是粘附在宿主的上皮細(xì)胞上，然后在以上所述的白念珠菌致病因素作用下形成感染灶。粘附在上皮細(xì)胞是因?yàn)樗拗骷?xì)胞膜表面上有白念珠菌的粘附受體，即巖藻糖和N-乙酰葡萄胺[6]；白念珠菌胞壁上具有多種粘附介導(dǎo)體，其中較為重要的有甘露聚糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物（M-P）和幾丁質(zhì)[7-8]。幾丁質(zhì)是（1-3，1-6）β-葡聚糖與N-乙酰葡萄糖受化合物而成的立體空間多聚體；白念珠菌胞壁具有纖維蛋白原，纖維連接蛋白等成分的粘著受體[9]。說明（1，3）-β-D葡聚糖水平同真菌感染間存在著十分密切的聯(lián)系[10-11]。因此本文研究（1，3）-β-D葡聚糖水平同藥物治療白色念珠菌病療效間的關(guān)系，以此確定藥物的療效情況。

本研究結(jié)果顯示：用藥前顯示模型組及治療組的菌落計(jì)數(shù)及血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平明顯高于對(duì)照組，說明（1，3）-β-D葡聚糖水平升高反映了真菌感染的存在；治療組（1，3）-β-D葡聚糖水平及菌落計(jì)數(shù)隨治療天數(shù)增加逐漸降低，且在用藥后3d開始同模型組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明抗菌藥物藥物氟康唑療效顯著。治療組及模型組各時(shí)間血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平同念珠菌菌落計(jì)數(shù)具有相關(guān)性。這些指標(biāo)為早期診斷真菌性血流感染提供一定的參考價(jià)值，且各指標(biāo)的水平高低與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果說明血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映念珠菌菌落計(jì)數(shù)情況，可以間接說明藥物的療效情況然而在實(shí)際臨床檢驗(yàn)中[12]，也可能出現(xiàn)血漿（1，3）-β-D葡聚糖水平異常升高或降低而同白色念珠菌病間并無關(guān)系的情況[13]：比如說產(chǎn)時(shí)間透析患者的透析膜中所含的葡聚糖可能造成檢驗(yàn)指標(biāo)升高，某些免疫缺陷患者體內(nèi)的特有厚細(xì)胞膜的隱球菌可能造成檢驗(yàn)指標(biāo)降低[14-15]。因此在臨床中應(yīng)視具體情況具體分析。

綜上所述，（1，3）-β-D葡聚糖水平可以反映白色念珠菌病的感染程度，同時(shí)可以對(duì)抗菌藥物的療效做出評(píng)價(jià)，為臨床的進(jìn)一步治療提供幫助。