趙德蕊， 廖 怡， 劉苗苗， 楊青山， 吳家文

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 合肥 230012； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研實(shí)驗(yàn)中心， 合肥 230038； 3. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 合肥230012； 4. 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心， 合肥 230038； 5. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院， 合肥 230038)

核酸酶分為核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶兩大類，限制性核酸內(nèi)切酶能特異性識(shí)別切割雙鏈DNA上的特異核苷酸序列，又分為I、II和III 3種類型；I型和III型核酸內(nèi)切酶不僅能特異性切割核酸，而且能對(duì)特殊堿基進(jìn)行甲基化修飾，其中I型核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)；而III型核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)只有25個(gè)堿基對(duì)左右。II型核酸內(nèi)切酶只具有識(shí)別切割的功能，不能對(duì)堿基進(jìn)行修飾，所識(shí)別的多為短的回文序列，所切割的堿基序列即為所識(shí)別的序列。本實(shí)驗(yàn)克隆表達(dá)的苦參雙功能核酸酶1 (Sophoraflavescensbifunctional nuclease 1,SfBFN1) 屬于I型核酸內(nèi)切酶，具有降解核糖核酸和脫氧核糖核酸的雙重功能[1]，故稱為雙功能核酸酶1。

早期研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物的核糖核酸酶具有抗腫瘤活性，如豹蛙的核糖核酸酶可以治療惡性胸膜間皮瘤，對(duì)該蛋白的研究已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)[2-5]； 牛精液核糖核酸酶具有抗癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用[6]。植物核酸酶1也同樣具有抗腫瘤作用，如黑松花粉細(xì)胞外核酸酶1[7]和綠豆核酸酶1[8]都能使無胸腺小鼠體內(nèi)黑色素腫瘤縮小。Matousek等[9]克隆純化了番茄的雙功能核酸酶1，將這種酶及聚乙二醇修飾的化合物注射到無胸腺雌性小鼠體內(nèi)，并測(cè)試其抗癌活性，均可抑制小鼠體內(nèi)人黑色素瘤或前列腺癌的生長。靜脈注射蛇麻的雙功能核酸酶1到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)黑色素瘤或前列腺癌的生長也明顯受到抑制[10]。

苦參(SophoraflavescensAit.)為豆科植物，其干燥根具有清熱燥濕等功效，外治滴蟲性陰道炎[11]；還具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等作用[12-14]。近年來，雙功能核酸酶1基因已經(jīng)從擬南芥[1]、番茄[9]和蛇麻[10]等植物中成功被克隆，但未見苦參雙功能核酸酶1基因的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序利用苦參的功能基因資源，首次通過RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)擴(kuò)增了SfBFN1基因的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)，構(gòu)建了SfBFN1的克隆及表達(dá)載體，篩選了SfBFN1蛋白最適宜的體外表達(dá)條件，分析了SfBFN1蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為其開發(fā)成為抗癌蛋白質(zhì)藥物制劑奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦參(SophoraflavescensAit.)植株采自安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物園，由楊青山副教授鑒定。DNA凝膠提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和E.Z.N.A Plant RNA Kit購自德國OMEGA公司；酶制劑購自日本TaKaRa公司；引物合成及測(cè)序服務(wù)由上海生工完成。

1.2 菌株和載體質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α，pET22b(+)和pMD19T載體質(zhì)粒均購自TaKaRa生物公司； 表達(dá)菌株BL21購自北京索寶生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苦參總 RNA 的提取及 cDNA 合成

取苦參適量葉片，液氮速凍后研磨成粉，利用RNA提取試劑盒提取苦參總RNA。以Random為引物，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.2SfBFN1的克隆

利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物(SfBFN1-F：5′-ATGGGTTCTCTGAAAGGACCAATTGTTTG-3′，SfBFN1-R：5′-AAGTGTCCAGGATCTGTTCACGTTTTTTCC-3′)。25.0 μL RT-PCR反應(yīng)體系中16.0 μL ddH2O，2.5 μL 10×PCR buffer(Mg2+)，1.0 μL dNTP mixture(10 mmol/L)，1.0 μL 5.0 μmol/μL上下游引物，2.0 μL cDNA和1.5 μL rTaq酶。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，40℃退火30 s，72℃延伸1 min，共10個(gè)循環(huán)；隨后94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。

1.3.3SfBFN1克隆重組質(zhì)粒構(gòu)建

將純化的SfBFN1基因片段連接到pMD19T載體，利用菌液PCR鑒定陽性克隆，NdeI /XhoI酶切鑒定質(zhì)粒。

1.3.4SfBFN1表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建

將酶切后純化的SfBFN1基因片段連接到pET22b (+) 空載體，鑒定方法同上。

1.3.5重組質(zhì)粒 pET22b-SfBFN1在大腸桿菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET22b-SfBFN1擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6，再分別加入不同濃度的IPTG(IPTG濃度分別為0、0.1、0.5和1.0 mmol/L)，在不同溫度及時(shí)間下分別誘導(dǎo)蛋白表達(dá)(16℃誘導(dǎo)24 h、25℃誘導(dǎo)8 h和37℃誘導(dǎo)6 h)。

1.3.6 蛋白Western Blot檢測(cè)

SDS-PAGE電泳結(jié)束后，采用200 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h及37℃封閉(2 g脫脂奶粉和40 mL PBST)1.5 h，經(jīng)過4℃一抗(1∶100)孵育過夜和37℃二抗(1∶2500)孵育1 h，最后暗室曝光。

1.3.7 蛋白生物信息學(xué)分析

利用序列處理在線工具包The Sequence Manipulation Suite(http://www.bio-soft.net/sms/index.html)將SfBFN1的堿基序列翻譯為氨基酸序列。通過ExPASy Protparam[15](http://web.expasy.org/protparam/)和Motif Scan(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan/)分析SfBFN1蛋白的理化特性及結(jié)構(gòu)域。使用MEGA 5.0[16]軟件建立SfBFN1蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。利用PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)軟件預(yù)測(cè)了SfBFN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，利用PyMOL[17-18]軟件對(duì)SfBFN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 SfBFN1的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用RNA提取試劑盒獲得苦參總RNA，結(jié)果如圖1-A；mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SfBFN1的引物對(duì)其ORF片段進(jìn)行克隆，結(jié)果如圖1-B。

將PCR產(chǎn)物與pMD19T載體連接獲得重組質(zhì)粒，菌液PCR及酶切鑒定如圖1-C、D。酶切pMD19T-SfBFN1質(zhì)粒與同樣酶切的pET22b(+) 載體連接獲得重組質(zhì)粒，菌液PCR及酶切鑒定如圖1-E、F。SfBFN1基因序列及其蛋白質(zhì)序列信息已投遞到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MG891836。

A：苦參總RNA 提取，1、2為平行樣品；B：SfBFN1基因讀碼框的克隆；C ：重組質(zhì)粒pMD19T-SfBFN1菌液PCR鑒定圖；D： 重組質(zhì)粒pMD19T-SfBFN1酶切鑒定圖；E：重組質(zhì)粒pET22b-SfBFN1菌液PCR鑒定圖；F：重組質(zhì)粒pET22b-SfBFN1酶切鑒定圖。箭頭指示目的條帶

圖1SfBFN1基因讀碼框序列的克隆及重組質(zhì)粒鑒定
Figure 1 The ORF cloning ofSfBFN1 and identification of recombinant plasmids

M: Marker; 1～4 分別代表在 16℃下培養(yǎng)24 h， IPTG 終濃度為0、0.1、0.5和1.0 mmol/L 時(shí)的蛋白表達(dá)情況；5～8 分別代表在 25℃下培養(yǎng)8 h， IPTG 終濃度為0、0.1、0.5及1.0 mmol/L時(shí)的蛋白表達(dá)情況；9～12 分別代表在 37℃下培養(yǎng)6 h， IPTG 終濃度為 0、0.1、0.5及1.0 mmol/L時(shí)的蛋白質(zhì)表達(dá)情況

圖2SfBFN1的誘導(dǎo)表達(dá)情況
Figure 2 Expression ofSfBFN1

2.2 重組質(zhì)粒 pET22b-SfBFN1的誘導(dǎo)表達(dá)

將pET22b-SfBFN1轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，以不同的IPTG 濃度分別在16℃、25℃和37℃誘導(dǎo)表達(dá)，利用Western Blot鑒定目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果(如圖2)顯示：在37℃下，當(dāng)IPTG的終濃度為0.5 mmol/L時(shí)目的蛋白的表達(dá)量最多(*標(biāo)示)。

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1SfBFN1序列分析

將SfBFN1的cDNA 序列翻譯成蛋白質(zhì)序列，如圖 3 所示：讀碼框長度為984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，TAA為終止密碼子。

圖3 SfBFN1的開放讀碼框序列和氨基酸序列Figure 3 ORF and amino acid sequence of SfBFN1

2.3.2 SfBFN1蛋白理化性質(zhì)

利用Protparam 在線軟件分析SfBFN1蛋白，其分子式C1585H2573N447O466S26，相對(duì)分子質(zhì)量約為36.2 ku，理論等電點(diǎn)8.9，280 nm處的摩爾消光系數(shù)為29 045 M-1·cm-1。該蛋白含有30個(gè)纈氨酸(Val)，其含量為9.2%；含有41個(gè)正電荷氨基酸和33個(gè)負(fù)電荷氨基酸。

2.3.3 SfBFN1基元及結(jié)構(gòu)域分析

Motif Scan分析顯示SfBFN1編碼蛋白的基元和結(jié)構(gòu)域信息見表1，主要含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)等。

2.3.4 SfBFN1分子系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用 NCBI中SmartBlast在線軟件對(duì)SfBFN1編碼蛋白進(jìn)行序列比對(duì)；通過MEGA5.0軟件對(duì)不同物種雙功能核酸酶1進(jìn)行同源進(jìn)化樹分析(圖4)，SfBFN1的蛋白序列與羽扇豆、花生及木豆等豆科植物的雙功能核酸酶1蛋白序列的同源性約為80%，說明該酶在豆科植物之間具有保守性；其中，SfBFN1與羽扇豆雙功能核酸酶1蛋白序列的同源性高達(dá)84%，它們之間的遺傳距離最短，其親緣關(guān)系最近。

表1 SfBFN1蛋白的基元及功能信息

Lupinusangustifolius(XP_019416686.1)；Arachisipaensis(XP_016167659.1)；Cajanuscajan(XP_020219569.1)；Vignasinensis(XP_014504471.1)；Vignaangularis(XP_017428013.1)；Malusdomestica(XP_008359765.1)；Pyrusbretschneideri(XP_009335956.1)；Arabidopsislyrata(XP_020891185.1)；Brassicaoleracea(XP_013621486.1)；Raphanussativus(XP_018472402.1)；Brassicarapa(XP_009128096.1)；Camelinasativa(XP_010416415.1)

圖4 SfBFN1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Figure 4 Phylogenetic analysis of SfBFN1 protein

圖A 中1為二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖(綠色示意α螺旋，藍(lán)色示意β折疊)；2 為SfBFN1蛋白氨基酸序列；3 為模板TMO160 蛋白(PDB ID: 1sj5)氨基酸序列；4 為模板TMO160 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖B為 SfBFN1的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(紅色示意α螺旋，黃色示意β折疊)

圖5 SfBFN1蛋白結(jié)構(gòu)模型
Figure 5 The structure model of SfBFN1 protein

2.3.5 SfBFN1蛋白結(jié)構(gòu)

本研究利用PHYRE2在線軟件預(yù)測(cè)了SfBFN1蛋白的部分三級(jí)結(jié)構(gòu)，氨基酸序列覆蓋率為40%(覆蓋SfBFN1蛋白132個(gè)氨基酸殘基，分別為Q123-D142、T144-V211和E214-K257，序列一致性為23%，可信度為100%)。結(jié)果顯示SfBFN1酶蛋白中央保守區(qū)域 (Q123-K257) 富含α螺旋和β折疊，其中含5個(gè)α螺旋 (E154-A162、L174-M185、P223-C234、K242-D248和F254-G256) 和7個(gè)β折疊(A135-M140、C146-V152、E188-V198、A201-K210、C217-D211、I228-R233和I238-N241)，如圖5-A所示。

利用PyMOL軟件對(duì)SfBFN1的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行繪制(圖5-B，結(jié)構(gòu)區(qū)域?yàn)镼123-K257)。SfBFN1酶蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中7個(gè)β折疊被5個(gè)α 螺旋包裹在內(nèi)部，構(gòu)成了蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的內(nèi)部框架。

3 結(jié)論與展望

本實(shí)驗(yàn)成功克隆了SfBFN1基因的開放閱讀框，篩選了SfBFN1蛋白的體外表達(dá)條件，分析了其理化性質(zhì)、同源關(guān)系及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)SfBFN1蛋白與羽扇豆的雙功能核酸酶1蛋白之間的遺傳距離最短，同源性高達(dá)84%，這與苦參是豆科植物是相符的。

植物雙功能核酸酶1具有重要的生物學(xué)功能[19-20]，如氧響應(yīng)因子1通過與雙功能核酸酶1的啟動(dòng)子結(jié)合從而影響擬南芥葉片的衰老[21]，雙功能核酸酶1的啟動(dòng)子不僅在衰老的器官中有活性，在其他器官中(如正在發(fā)育的花、種子，以及受精后的花等)也有活性，說明該酶還參與擬南芥不同的生長發(fā)育過程[22]。

動(dòng)物核酸酶能抑制和殺死腫瘤細(xì)胞，如牛胰腺核糖核酸酶、牛精液核糖核酸酶和豹蛙的核糖核酸酶等，這些酶與細(xì)胞的相互作用大多是非特異性的，所以它們的應(yīng)用會(huì)引起較強(qiáng)的毒副作用，例如代謝變化、免疫反應(yīng)或干擾精子生長等[23-24]。雖然植物核酸酶的功能尚未被廣泛發(fā)掘，但已證實(shí)它具有抗腫瘤作用及較小的毒副反應(yīng)，其原因可能是動(dòng)植物具有不同的糖基化模式[9,25]，故植物雙功能核酸酶1蛋白作為潛在的抗腫瘤抑制劑引起了越來越多的關(guān)注。

通過X射線熒光光譜法發(fā)現(xiàn)番茄的雙功能核酸酶1 蛋白中鋅離子有3種空間排列方式，且該蛋白通過二硫鍵保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這點(diǎn)與牛精液核糖核酸酶的結(jié)構(gòu)類似[26]。研究還發(fā)現(xiàn)番茄、蛇麻及蕓苔的雙功能核酸酶1蛋白具有桔青霉核酸酶1相似的結(jié)構(gòu)特征，且這三種雙功能核酸酶經(jīng)過N-糖基化修飾后切割雙鏈DNA，該過程由Zn2+催化發(fā)生[27-30]。SfBFN1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)富含α螺旋與β折疊，5個(gè)α 螺旋包裹著7個(gè)β折疊，構(gòu)成了穩(wěn)定的立體結(jié)構(gòu)，且蛋白中含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(表1)，蛋白質(zhì)序列中含有10個(gè)半胱氨酸，推測(cè)此蛋白酶也是通過二硫鍵保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，由Zn2+催化此酶經(jīng)過N-糖基化修飾后切割雙鏈DNA。本研究為進(jìn)一步純化SfBFN1蛋白，將其開發(fā)成抗癌藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。