焦 超，李婧雅，李利君,2，楊秋明,2， 翁惠芬,3，肖安風(fēng),2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021；3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

普魯寧是一種具有降低膽固醇、抗氧化及抗病毒等功效的黃酮苷類物質(zhì)，在食品和藥物方面有很好的應(yīng)用前景[1-3]。但是，普魯寧在自然界中的豐度較低，難以從生物組織中提取制備。因此，研究人員將目光轉(zhuǎn)向了可以制備普魯寧的柚皮苷(4′-5,7′一三羥基二氫黃酮-7-鼠李糖葡萄糖苷)，它是一類二氫黃酮類化合物，是枳實(shí)、化橘紅等幾味中藥的主要有效成分[4]。柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下可發(fā)生特異性水解反應(yīng)脫掉α-L-鼠李糖，生成普魯寧。

相關(guān)研究表明[5-6]，以柚皮苷為底物，利用α-L-鼠李糖苷酶生物轉(zhuǎn)化是制備普魯寧的有效手段。但是由于柚皮苷是一種極性化合物，不但難溶于油脂[7]，而且在水溶液中以游離狀態(tài)存在時(shí)溶解性也很差。雖然柚皮苷易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，但是使用有機(jī)溶劑代替水溶液進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí)，又會(huì)破壞酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，酶的活性和穩(wěn)定性受到影響。因此，研究增大酶與柚皮苷的接觸，提高柚皮苷作為酶解底物的利用度是非常有必要的。

酶催化固相底物反應(yīng)是一種將底物固定在固相載體上，然后溶解在溶液中的酶擴(kuò)散到底物附近與之接觸，發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)形式[8]。根據(jù)此反應(yīng)機(jī)制，利用可以特異性吸附黃酮類化合物的大孔吸附樹脂，將柚皮苷固定在樹脂載體上，之后游離酶擴(kuò)散到固定化的柚皮苷附近而與之發(fā)生反應(yīng)，可以很好改善底物溶解性。有關(guān)酶催化固相底物反應(yīng)的應(yīng)用研究很多，Ulijn等[9]報(bào)道了一種蛋白酶催化的多肽合成，將底物氨基酸固定在PEGA1900載體上，而后在水溶液中用嗜熱菌蛋白酶將氨基酸直接合成二肽，產(chǎn)量高達(dá)99%。Wang等[10]利用可控多孔玻璃(controlled pore glass，CPG)固定核苷，制備出含有二硫鍵單元的肽-寡核苷酸偶聯(lián)物。本文選擇了幾種大孔吸附樹脂對(duì)柚皮苷進(jìn)行固定化，選擇出滿足條件的最優(yōu)樹脂，對(duì)酶催化固相底物反應(yīng)進(jìn)行初步研究，反應(yīng)條件溫和，選擇性高，產(chǎn)物容易分離，符合綠色化學(xué)的發(fā)展方向，為柚皮苷的生物轉(zhuǎn)化提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 重組α-L-鼠李糖苷酶的制備

將含有重組質(zhì)粒pPIC9K-rha的畢赤酵母GS115菌株進(jìn)行活化，活化后的菌液轉(zhuǎn)接至BMGY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，收集A600≥3.0的菌體，根據(jù)畢勝[11]細(xì)胞重懸方法重懸后，置于搖床在30 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組α-L-鼠李糖苷酶，發(fā)酵72 h后，室溫3500 r/min離心10 min，收集上清液。

1.2 α-L-鼠李糖苷酶活力的測(cè)定

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[12-13]，以柚皮苷為底物進(jìn)行酶活力的測(cè)定，測(cè)定的反應(yīng)體系為：950 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.0)加入1 mL 300 mg/L的底物和50 μL的酶液，50 ℃反應(yīng)15 min后，過0.22 μm濾膜后利用HPLC測(cè)定反應(yīng)液中柚皮苷和普魯寧的含量。在50 ℃、pH=5.0的條件下反應(yīng)1 min，消耗1 μg柚皮苷所需的α-L-鼠李糖苷酶的量定義為一個(gè)α-L-鼠李糖苷酶活力單位。

1.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

具體流程如下：漂浮篩選→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇泡24 h→濕法上柱→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗→蒸餾水洗→2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸泡3 h→蒸餾水洗→2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉泡3 h→蒸餾水洗。

1.4 柚皮苷的固定化

分別將0.5 g濕重的5種大孔吸附樹脂加入到50 mL 0.2% (g/mL)的柚皮苷溶液中，置于50 ℃的恒溫振蕩水浴中充分振蕩固定，至上清液中柚皮苷濃度不再發(fā)生變化為止。

1.5 柚皮苷吸附量的測(cè)定

HPLC法檢測(cè)樹脂吸附前后柚皮苷溶液中柚皮苷濃度的變化，并根據(jù)下式計(jì)算出樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量：樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量(mg/g)=(C0-C1)×V/m,式中：C0、C1分別表示柚皮苷溶液在樹脂吸附前后的濃度(g/L)；V表示柚皮苷溶液的體積(mL)；m表示樹脂的用量(g，濕重)。

1.6 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解過程分析

取0.4 g預(yù)處理好的樹脂加入到0.002 g/mL的柚皮苷溶液中，緩沖液pH=5.0，置于50 ℃水浴中恒溫振蕩固定，同時(shí)加入α-L-鼠李糖苷酶酶液，反應(yīng)體系的總體積為20 mL。在振速為120 r/min下酶催化固定化柚皮苷反應(yīng)360 min，每隔一段時(shí)間取樣一次，沸水滅活10 min后，冷卻至室溫，測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖、柚皮苷及普魯寧的含量隨時(shí)間的變化情況。在此基礎(chǔ)上，通過柚皮苷酶解過程中還原糖的生成量，來考察酶用量、底物濃度、pH值、溫度、振蕩速度及金屬離子等對(duì)固定化柚皮苷酶解作用的影響。

1.7 柚皮苷轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

柚皮苷轉(zhuǎn)化率/%=[還原糖生成量/182.11×580.53]/柚皮苷總質(zhì)量×100，其中，182.11為鼠李糖相對(duì)分子質(zhì)量，580.53為柚皮苷相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8 α-L-鼠李糖苷酶水解固定柚皮苷的動(dòng)力學(xué)分析

以固定化柚皮苷為底物，α-L-鼠李糖苷酶粗酶液為催化劑，在不同的底物濃度下，于60 ℃，120 r/min振蕩器中反應(yīng)360 min，每60 min取樣一次，沸水水浴15 min滅活后測(cè)定酶解液中還原糖的生成量，制作α-L-鼠李糖苷酶水解固定化柚皮苷的動(dòng)力學(xué)模型并計(jì)算參數(shù)Km和Vmax[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化柚皮苷樹脂載體的選擇

選擇5種國產(chǎn)大孔吸附樹脂作為固定化柚皮苷的載體，通過研究樹脂對(duì)柚皮苷的吸附量，以及各樹脂固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶催化作用下的酶解反應(yīng)效果，得出最佳的樹脂載體。采用HPLC法測(cè)定5種樹脂對(duì)柚皮苷的吸附量，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見，5種樹脂載體對(duì)柚皮苷飽和吸附量大小為D4020>D101-1>AB-8>D101>DM130。而從圖2中可以明顯看出，反應(yīng)2 h各樹脂固定化柚皮苷的酶解作用差異不大，但是2 h后D101-1樹脂固定化柚皮苷后酶解作用明顯強(qiáng)于其他樹脂，與圖1中5種樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量結(jié)果結(jié)合可得出，D101-1樹脂對(duì)柚皮苷的吸附效果及酶解反應(yīng)效果最好。因此綜合樹脂載體對(duì)柚皮苷的吸附量以及酶解催化反應(yīng)效果，選擇D101-1大孔吸附樹脂做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解過程分析

在20 mL反應(yīng)體系中，固定其他條件不變，改變?chǔ)?L-鼠李糖苷酶的加酶量，催化柚皮苷進(jìn)行酶解反應(yīng)6 h，測(cè)定反應(yīng)液中還原糖生成量，計(jì)算柚皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化情況，其結(jié)果如圖3a所示。從圖3a中可以看出，隨著加酶量的增加，柚皮苷轉(zhuǎn)化率明顯增加，反應(yīng)初速率也相應(yīng)增大。這是由于增加了加酶量使反應(yīng)液中濃度一定的底物在單位體積、單位時(shí)間內(nèi)接觸酶的機(jī)率增大，所以催化反應(yīng)初速率會(huì)增大，轉(zhuǎn)化率也增加。當(dāng)加酶量增大到30 U/mL，繼續(xù)增加加酶量，柚皮苷的轉(zhuǎn)化率變化不大，反應(yīng)到3 h后基本一致，對(duì)酶解反應(yīng)的促進(jìn)作用不大。因此，選擇加酶量為30 U/mL。然而與游離酶催化柚皮苷的酶解轉(zhuǎn)化相比，將柚皮苷固定化后酶解速率有所減慢，所用酶量增加而且反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)，這可能是由于樹脂載體的存在阻礙了酶與底物的接觸所致。

從圖3b中可以看出,其他反應(yīng)條件固定，隨著底物濃度增大，酶解反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間延長(zhǎng)，還原糖生成量變大，但是增加量越來越少。當(dāng)柚皮苷濃度較低時(shí)，酶相對(duì)過量，酶反應(yīng)很快達(dá)到平衡。而當(dāng)柚皮苷濃度較高時(shí)，酶與底物接觸機(jī)會(huì)增大，酶反應(yīng)初速率有一定加快，還原糖的生成量相應(yīng)增加，但是反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間也會(huì)增加。反應(yīng)生成的還原糖對(duì)反應(yīng)有一定的抑制作用，因此隨著底物濃度的增大，還原糖的增加量越來越少。柚皮苷的轉(zhuǎn)化率計(jì)算時(shí)是以底物濃度為分母，所以底物濃度變大，分母不變時(shí)所得轉(zhuǎn)化率會(huì)小。因此，要綜合考慮還原糖生成量和柚皮苷轉(zhuǎn)化率來確定最適底物濃度。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為2.4 g/L時(shí)，柚皮苷轉(zhuǎn)化率最高，底物質(zhì)量濃度大于2.4 g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率反而減小，所以最后選擇底物質(zhì)量濃度為2.4 g/L。

pH值對(duì)酶活力有很大的影響，過酸或過堿等不適宜的條件都會(huì)使酶活力降低甚至喪失，只有在最適pH值的條件下才可以顯現(xiàn)出其最大活力。因此，考察pH值對(duì)柚皮苷酶解作用的影響十分有必要。改變反應(yīng)體系中緩沖液的pH值，考察柚皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化曲線，其變化趨勢(shì)如圖4a所示。pH值對(duì)酶反應(yīng)的初始速率、還原糖生成量以及柚皮苷轉(zhuǎn)化率都有一定影響。由圖4a可知，pH=3.5～4.5，轉(zhuǎn)化率差別不大，但是相對(duì)其他pH值范圍的轉(zhuǎn)化率要高，pH值繼續(xù)增大，轉(zhuǎn)化率反而減小，說明該酶適應(yīng)酸性環(huán)境，在pH=4時(shí)酶解反應(yīng)穩(wěn)定增加且效果相對(duì)較好，與游離酶催化柚皮苷水解反應(yīng)的最適pH值一致，因此在酶解反應(yīng)中選擇緩沖液pH=4.0。

酶催化反應(yīng)的速率與反應(yīng)溫度有很大的關(guān)系，在最適溫度條件下酶才可以表現(xiàn)出最大酶活力，但生物酶作為一種蛋白質(zhì)，當(dāng)溫度超過其可接受范圍時(shí)，易變性而失活。由圖4b可知，隨著溫度升高，酶解反應(yīng)初速率相應(yīng)增大，柚皮苷轉(zhuǎn)化率也隨之增高。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)酶反應(yīng)的初速率最大，柚皮苷轉(zhuǎn)化率最高，但是當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃后0.5 h內(nèi)酶已基本失活，酶蛋白的變性是隨時(shí)間的延長(zhǎng)而累加的。所以選擇酶反應(yīng)的最適溫度為60 ℃。

固定其他反應(yīng)條件不變，分別加入濃度為5 mmol/L的不同金屬離子，酶解反應(yīng)1 h后取樣測(cè)定金屬離子對(duì)酶解反應(yīng)的影響，所得結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，金屬離子可參與催化反應(yīng)，與空白組相比較，Mn2+、Fe2+和Co2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用，其中5 mmol/L的Fe2+促進(jìn)作用最強(qiáng)；Na+、Ca2+、K+、Mg2+和Zn2+對(duì)酶活力影響不大；Fe3+和Cu2+對(duì)酶活力有明顯的抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最強(qiáng)。

進(jìn)一步考察不同濃度的Mn2+和Fe2+對(duì)酶反應(yīng)的促進(jìn)作用，結(jié)果見圖6。由圖6a可知，與空白組相比較，低濃度的Mn2+對(duì)酶解反應(yīng)的影響不大，反應(yīng)初速率以及反應(yīng)初期柚皮苷轉(zhuǎn)化率都幾乎相同，到反應(yīng)后期顯示出一些促進(jìn)作用，但是作用不大。高濃度的Mn2+對(duì)酶解反應(yīng)具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，Mn2+可能作為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的促進(jìn)劑。由圖6b可知，低濃度的Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)幾乎沒有促進(jìn)作用，當(dāng)Fe2+濃度為0.1 ，0.5，1 mmol/L時(shí)初始反應(yīng)速率和柚皮苷轉(zhuǎn)化率都沒有明顯的變化，當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，初始反應(yīng)速率很快，但是后來由于反應(yīng)溫度高，在反應(yīng)液中的Fe2+被氧化，顏色變成棕色，柚皮苷轉(zhuǎn)化率不再增加，說明高濃度的Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)有極強(qiáng)的促進(jìn)作用。

2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證和1 L放大試驗(yàn)

根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果，在加酶量為30 U/mL、pH=4.0、溫度為60 ℃、振蕩速率為80 r/min、底物質(zhì)量濃度為2.4 g/L的條件下進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證和1 L放大試驗(yàn)，結(jié)果見圖7。由圖7可以看出，采用最優(yōu)條件進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí)，初速率大于未優(yōu)化前，柚皮苷轉(zhuǎn)化率在420 min時(shí)可達(dá)到78%，最終產(chǎn)物生成量也有所提高。但是，與游離柚皮苷的酶解反應(yīng)相比，柚皮苷的轉(zhuǎn)化率有所下降，而且酶解反應(yīng)達(dá)到平衡所用的時(shí)間大大延長(zhǎng)。這可能是由于柚皮苷與載體樹脂結(jié)合后形成了空間位阻，在一定程度上阻止了柚皮苷與酶分子的接觸反應(yīng)。反應(yīng)體系放大到1 L后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖生成量不斷增加，柚皮苷轉(zhuǎn)化率也不斷增大，酶解反應(yīng)420 min后基本達(dá)到平衡，柚皮苷轉(zhuǎn)化率約為75%，這與20 mL反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.4 酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

由圖8可知，反應(yīng)初速率-底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合方程為y=38.929x+1.9074，計(jì)算酶解反應(yīng)的Km值和最大反應(yīng)速率Vmax值，得到：Km=5.12 g/L,Vmax= 0.013 g/(L·min)。而游離柚皮苷酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏常數(shù)Km=0.588 g/L，Vmax=0.011 g/(L·min)。對(duì)比固定化柚皮苷前后的Km值可以看出，柚皮苷經(jīng)固定化后Km增大很多，說明底物固定化以后，由于樹脂載體內(nèi)部的空間位阻和擴(kuò)散效應(yīng)造成酶與底物的親和性降低，反應(yīng)初速率下降。

2.5 TLC和HPLC法分析反應(yīng)產(chǎn)物

在最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化，可以得到反應(yīng)產(chǎn)物鼠李糖和普魯寧。分別在反應(yīng)前和反應(yīng)后取樣檢測(cè)驗(yàn)證其中的反應(yīng)產(chǎn)物，薄層層析結(jié)果可直觀反映出酶解反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖9所示。對(duì)照薄層層析圖中柚皮苷、普魯寧以及鼠李糖的顏色和位置可以看出，反應(yīng)前反應(yīng)液中只有柚皮苷，加入α-L-鼠李糖苷酶反應(yīng)一段時(shí)間后，柚皮苷逐漸水解轉(zhuǎn)化成普魯寧和鼠李糖，反應(yīng)7 h達(dá)到平衡后柚皮苷轉(zhuǎn)化率為80%，反應(yīng)液中產(chǎn)物為普魯寧和鼠李糖，還有些殘余的柚皮苷。說明該重組的α-L-鼠李糖苷酶與柚皮苷特異性反應(yīng)的產(chǎn)物中不會(huì)含有柚皮素，省去了用柚苷酶水解柚皮苷生成柚皮素的干擾，使產(chǎn)物普魯寧分離純化變得簡(jiǎn)單。

在最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)，固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化，可以得到反應(yīng)產(chǎn)物鼠李糖和普魯寧。分別在反應(yīng)前、反應(yīng)中間和反應(yīng)后取樣留待檢測(cè)驗(yàn)證其中的反應(yīng)產(chǎn)物，HPLC結(jié)果如圖10所示。由圖10可見，加酶液前反應(yīng)液中只含有柚皮苷，加入酶液反應(yīng)后，柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下逐漸反應(yīng)轉(zhuǎn)化成了普魯寧，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)液中柚皮苷量逐漸減少，普魯寧的生成量逐漸增多，反應(yīng)7 h后反應(yīng)基本達(dá)到平衡，反應(yīng)液中含有產(chǎn)物普魯寧和少量未轉(zhuǎn)化完全的柚皮苷。該檢測(cè)方法檢測(cè)不出還原糖的生成，但是可以確定反應(yīng)產(chǎn)物中沒有柚皮素的生成。

3 結(jié)論

對(duì)α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解條件進(jìn)行考察，在所考察的5種大孔吸附樹脂中，最適合用作載體的樹脂為D101-1大孔吸附樹脂。α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解的最適反應(yīng)條件為：酶用量30 U/mL，反應(yīng)溫度60 ℃，pH=4.0，底物質(zhì)量濃度2.4 g/L，振蕩速率80 r/min。在此條件下反應(yīng)420 min，柚皮苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到78%。高濃度的Mn2+、Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)有極強(qiáng)的促進(jìn)作用。通過最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)及1 L放大試驗(yàn)證明了該優(yōu)化工藝具有良好的重現(xiàn)性。最后利用TLC法和HPLC驗(yàn)證得出，反應(yīng)完全后可得到純的普魯寧。