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固定化柚皮苷酶解轉(zhuǎn)化制備普魯寧

2019-04-19 05:24:14李婧雅李利君楊秋明翁惠芬肖安風(fēng)
關(guān)鍵詞:柚皮苷糖苷酶底物

焦 超,李婧雅,李利君,2,楊秋明,2, 翁惠芬,3,肖安風(fēng),2,3

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;3.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心,福建 廈門 361021)

0 引言

普魯寧是一種具有降低膽固醇、抗氧化及抗病毒等功效的黃酮苷類物質(zhì),在食品和藥物方面有很好的應(yīng)用前景[1-3]。但是,普魯寧在自然界中的豐度較低,難以從生物組織中提取制備。因此,研究人員將目光轉(zhuǎn)向了可以制備普魯寧的柚皮苷(4′-5,7′一三羥基二氫黃酮-7-鼠李糖葡萄糖苷),它是一類二氫黃酮類化合物,是枳實(shí)、化橘紅等幾味中藥的主要有效成分[4]。柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下可發(fā)生特異性水解反應(yīng)脫掉α-L-鼠李糖,生成普魯寧。

相關(guān)研究表明[5-6],以柚皮苷為底物,利用α-L-鼠李糖苷酶生物轉(zhuǎn)化是制備普魯寧的有效手段。但是由于柚皮苷是一種極性化合物,不但難溶于油脂[7],而且在水溶液中以游離狀態(tài)存在時(shí)溶解性也很差。雖然柚皮苷易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑,但是使用有機(jī)溶劑代替水溶液進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí),又會(huì)破壞酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),酶的活性和穩(wěn)定性受到影響。因此,研究增大酶與柚皮苷的接觸,提高柚皮苷作為酶解底物的利用度是非常有必要的。

酶催化固相底物反應(yīng)是一種將底物固定在固相載體上,然后溶解在溶液中的酶擴(kuò)散到底物附近與之接觸,發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)形式[8]。根據(jù)此反應(yīng)機(jī)制,利用可以特異性吸附黃酮類化合物的大孔吸附樹脂,將柚皮苷固定在樹脂載體上,之后游離酶擴(kuò)散到固定化的柚皮苷附近而與之發(fā)生反應(yīng),可以很好改善底物溶解性。有關(guān)酶催化固相底物反應(yīng)的應(yīng)用研究很多,Ulijn等[9]報(bào)道了一種蛋白酶催化的多肽合成,將底物氨基酸固定在PEGA1900載體上,而后在水溶液中用嗜熱菌蛋白酶將氨基酸直接合成二肽,產(chǎn)量高達(dá)99%。Wang等[10]利用可控多孔玻璃(controlled pore glass,CPG)固定核苷,制備出含有二硫鍵單元的肽-寡核苷酸偶聯(lián)物。本文選擇了幾種大孔吸附樹脂對(duì)柚皮苷進(jìn)行固定化,選擇出滿足條件的最優(yōu)樹脂,對(duì)酶催化固相底物反應(yīng)進(jìn)行初步研究,反應(yīng)條件溫和,選擇性高,產(chǎn)物容易分離,符合綠色化學(xué)的發(fā)展方向,為柚皮苷的生物轉(zhuǎn)化提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 重組α-L-鼠李糖苷酶的制備

將含有重組質(zhì)粒pPIC9K-rha的畢赤酵母GS115菌株進(jìn)行活化,活化后的菌液轉(zhuǎn)接至BMGY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),收集A600≥3.0的菌體,根據(jù)畢勝[11]細(xì)胞重懸方法重懸后,置于搖床在30 ℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組α-L-鼠李糖苷酶,發(fā)酵72 h后,室溫3500 r/min離心10 min,收集上清液。

1.2 α-L-鼠李糖苷酶活力的測(cè)定

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[12-13],以柚皮苷為底物進(jìn)行酶活力的測(cè)定,測(cè)定的反應(yīng)體系為:950 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH=5.0)加入1 mL 300 mg/L的底物和50 μL的酶液,50 ℃反應(yīng)15 min后,過0.22 μm濾膜后利用HPLC測(cè)定反應(yīng)液中柚皮苷和普魯寧的含量。在50 ℃、pH=5.0的條件下反應(yīng)1 min,消耗1 μg柚皮苷所需的α-L-鼠李糖苷酶的量定義為一個(gè)α-L-鼠李糖苷酶活力單位。

1.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

具體流程如下:漂浮篩選→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇泡24 h→濕法上柱→95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗→蒸餾水洗→2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸泡3 h→蒸餾水洗→2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉泡3 h→蒸餾水洗。

1.4 柚皮苷的固定化

分別將0.5 g濕重的5種大孔吸附樹脂加入到50 mL 0.2% (g/mL)的柚皮苷溶液中,置于50 ℃的恒溫振蕩水浴中充分振蕩固定,至上清液中柚皮苷濃度不再發(fā)生變化為止。

1.5 柚皮苷吸附量的測(cè)定

HPLC法檢測(cè)樹脂吸附前后柚皮苷溶液中柚皮苷濃度的變化,并根據(jù)下式計(jì)算出樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量:樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量(mg/g)=(C0-C1)×V/m,式中:C0、C1分別表示柚皮苷溶液在樹脂吸附前后的濃度(g/L);V表示柚皮苷溶液的體積(mL);m表示樹脂的用量(g,濕重)。

1.6 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解過程分析

取0.4 g預(yù)處理好的樹脂加入到0.002 g/mL的柚皮苷溶液中,緩沖液pH=5.0,置于50 ℃水浴中恒溫振蕩固定,同時(shí)加入α-L-鼠李糖苷酶酶液,反應(yīng)體系的總體積為20 mL。在振速為120 r/min下酶催化固定化柚皮苷反應(yīng)360 min,每隔一段時(shí)間取樣一次,沸水滅活10 min后,冷卻至室溫,測(cè)定反應(yīng)體系中還原糖、柚皮苷及普魯寧的含量隨時(shí)間的變化情況。在此基礎(chǔ)上,通過柚皮苷酶解過程中還原糖的生成量,來考察酶用量、底物濃度、pH值、溫度、振蕩速度及金屬離子等對(duì)固定化柚皮苷酶解作用的影響。

1.7 柚皮苷轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

柚皮苷轉(zhuǎn)化率/%=[還原糖生成量/182.11×580.53]/柚皮苷總質(zhì)量×100,其中,182.11為鼠李糖相對(duì)分子質(zhì)量,580.53為柚皮苷相對(duì)分子質(zhì)量。

1.8 α-L-鼠李糖苷酶水解固定柚皮苷的動(dòng)力學(xué)分析

以固定化柚皮苷為底物,α-L-鼠李糖苷酶粗酶液為催化劑,在不同的底物濃度下,于60 ℃,120 r/min振蕩器中反應(yīng)360 min,每60 min取樣一次,沸水水浴15 min滅活后測(cè)定酶解液中還原糖的生成量,制作α-L-鼠李糖苷酶水解固定化柚皮苷的動(dòng)力學(xué)模型并計(jì)算參數(shù)Km和Vmax[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化柚皮苷樹脂載體的選擇

選擇5種國產(chǎn)大孔吸附樹脂作為固定化柚皮苷的載體,通過研究樹脂對(duì)柚皮苷的吸附量,以及各樹脂固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶催化作用下的酶解反應(yīng)效果,得出最佳的樹脂載體。采用HPLC法測(cè)定5種樹脂對(duì)柚皮苷的吸附量,其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可見,5種樹脂載體對(duì)柚皮苷飽和吸附量大小為D4020>D101-1>AB-8>D101>DM130。而從圖2中可以明顯看出,反應(yīng)2 h各樹脂固定化柚皮苷的酶解作用差異不大,但是2 h后D101-1樹脂固定化柚皮苷后酶解作用明顯強(qiáng)于其他樹脂,與圖1中5種樹脂對(duì)柚皮苷的飽和吸附量結(jié)果結(jié)合可得出,D101-1樹脂對(duì)柚皮苷的吸附效果及酶解反應(yīng)效果最好。因此綜合樹脂載體對(duì)柚皮苷的吸附量以及酶解催化反應(yīng)效果,選擇D101-1大孔吸附樹脂做后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解過程分析

在20 mL反應(yīng)體系中,固定其他條件不變,改變?chǔ)?L-鼠李糖苷酶的加酶量,催化柚皮苷進(jìn)行酶解反應(yīng)6 h,測(cè)定反應(yīng)液中還原糖生成量,計(jì)算柚皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化情況,其結(jié)果如圖3a所示。從圖3a中可以看出,隨著加酶量的增加,柚皮苷轉(zhuǎn)化率明顯增加,反應(yīng)初速率也相應(yīng)增大。這是由于增加了加酶量使反應(yīng)液中濃度一定的底物在單位體積、單位時(shí)間內(nèi)接觸酶的機(jī)率增大,所以催化反應(yīng)初速率會(huì)增大,轉(zhuǎn)化率也增加。當(dāng)加酶量增大到30 U/mL,繼續(xù)增加加酶量,柚皮苷的轉(zhuǎn)化率變化不大,反應(yīng)到3 h后基本一致,對(duì)酶解反應(yīng)的促進(jìn)作用不大。因此,選擇加酶量為30 U/mL。然而與游離酶催化柚皮苷的酶解轉(zhuǎn)化相比,將柚皮苷固定化后酶解速率有所減慢,所用酶量增加而且反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng),這可能是由于樹脂載體的存在阻礙了酶與底物的接觸所致。

從圖3b中可以看出,其他反應(yīng)條件固定,隨著底物濃度增大,酶解反應(yīng)達(dá)到平衡所需時(shí)間延長(zhǎng),還原糖生成量變大,但是增加量越來越少。當(dāng)柚皮苷濃度較低時(shí),酶相對(duì)過量,酶反應(yīng)很快達(dá)到平衡。而當(dāng)柚皮苷濃度較高時(shí),酶與底物接觸機(jī)會(huì)增大,酶反應(yīng)初速率有一定加快,還原糖的生成量相應(yīng)增加,但是反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間也會(huì)增加。反應(yīng)生成的還原糖對(duì)反應(yīng)有一定的抑制作用,因此隨著底物濃度的增大,還原糖的增加量越來越少。柚皮苷的轉(zhuǎn)化率計(jì)算時(shí)是以底物濃度為分母,所以底物濃度變大,分母不變時(shí)所得轉(zhuǎn)化率會(huì)小。因此,要綜合考慮還原糖生成量和柚皮苷轉(zhuǎn)化率來確定最適底物濃度。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為2.4 g/L時(shí),柚皮苷轉(zhuǎn)化率最高,底物質(zhì)量濃度大于2.4 g/L時(shí),轉(zhuǎn)化率反而減小,所以最后選擇底物質(zhì)量濃度為2.4 g/L。

pH值對(duì)酶活力有很大的影響,過酸或過堿等不適宜的條件都會(huì)使酶活力降低甚至喪失,只有在最適pH值的條件下才可以顯現(xiàn)出其最大活力。因此,考察pH值對(duì)柚皮苷酶解作用的影響十分有必要。改變反應(yīng)體系中緩沖液的pH值,考察柚皮苷的轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的變化曲線,其變化趨勢(shì)如圖4a所示。pH值對(duì)酶反應(yīng)的初始速率、還原糖生成量以及柚皮苷轉(zhuǎn)化率都有一定影響。由圖4a可知,pH=3.5~4.5,轉(zhuǎn)化率差別不大,但是相對(duì)其他pH值范圍的轉(zhuǎn)化率要高,pH值繼續(xù)增大,轉(zhuǎn)化率反而減小,說明該酶適應(yīng)酸性環(huán)境,在pH=4時(shí)酶解反應(yīng)穩(wěn)定增加且效果相對(duì)較好,與游離酶催化柚皮苷水解反應(yīng)的最適pH值一致,因此在酶解反應(yīng)中選擇緩沖液pH=4.0。

酶催化反應(yīng)的速率與反應(yīng)溫度有很大的關(guān)系,在最適溫度條件下酶才可以表現(xiàn)出最大酶活力,但生物酶作為一種蛋白質(zhì),當(dāng)溫度超過其可接受范圍時(shí),易變性而失活。由圖4b可知,隨著溫度升高,酶解反應(yīng)初速率相應(yīng)增大,柚皮苷轉(zhuǎn)化率也隨之增高。當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)酶反應(yīng)的初速率最大,柚皮苷轉(zhuǎn)化率最高,但是當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃后0.5 h內(nèi)酶已基本失活,酶蛋白的變性是隨時(shí)間的延長(zhǎng)而累加的。所以選擇酶反應(yīng)的最適溫度為60 ℃。

固定其他反應(yīng)條件不變,分別加入濃度為5 mmol/L的不同金屬離子,酶解反應(yīng)1 h后取樣測(cè)定金屬離子對(duì)酶解反應(yīng)的影響,所得結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出,金屬離子可參與催化反應(yīng),與空白組相比較,Mn2+、Fe2+和Co2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用,其中5 mmol/L的Fe2+促進(jìn)作用最強(qiáng);Na+、Ca2+、K+、Mg2+和Zn2+對(duì)酶活力影響不大;Fe3+和Cu2+對(duì)酶活力有明顯的抑制作用,其中Fe3+的抑制作用最強(qiáng)。

進(jìn)一步考察不同濃度的Mn2+和Fe2+對(duì)酶反應(yīng)的促進(jìn)作用,結(jié)果見圖6。由圖6a可知,與空白組相比較,低濃度的Mn2+對(duì)酶解反應(yīng)的影響不大,反應(yīng)初速率以及反應(yīng)初期柚皮苷轉(zhuǎn)化率都幾乎相同,到反應(yīng)后期顯示出一些促進(jìn)作用,但是作用不大。高濃度的Mn2+對(duì)酶解反應(yīng)具有很強(qiáng)的促進(jìn)作用,Mn2+可能作為生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的促進(jìn)劑。由圖6b可知,低濃度的Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)幾乎沒有促進(jìn)作用,當(dāng)Fe2+濃度為0.1 ,0.5,1 mmol/L時(shí)初始反應(yīng)速率和柚皮苷轉(zhuǎn)化率都沒有明顯的變化,當(dāng)Fe2+濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí),初始反應(yīng)速率很快,但是后來由于反應(yīng)溫度高,在反應(yīng)液中的Fe2+被氧化,顏色變成棕色,柚皮苷轉(zhuǎn)化率不再增加,說明高濃度的Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)有極強(qiáng)的促進(jìn)作用。

2.3 最優(yōu)工藝驗(yàn)證和1 L放大試驗(yàn)

根據(jù)前面的試驗(yàn)結(jié)果,在加酶量為30 U/mL、pH=4.0、溫度為60 ℃、振蕩速率為80 r/min、底物質(zhì)量濃度為2.4 g/L的條件下進(jìn)行最優(yōu)工藝驗(yàn)證和1 L放大試驗(yàn),結(jié)果見圖7。由圖7可以看出,采用最優(yōu)條件進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí),初速率大于未優(yōu)化前,柚皮苷轉(zhuǎn)化率在420 min時(shí)可達(dá)到78%,最終產(chǎn)物生成量也有所提高。但是,與游離柚皮苷的酶解反應(yīng)相比,柚皮苷的轉(zhuǎn)化率有所下降,而且酶解反應(yīng)達(dá)到平衡所用的時(shí)間大大延長(zhǎng)。這可能是由于柚皮苷與載體樹脂結(jié)合后形成了空間位阻,在一定程度上阻止了柚皮苷與酶分子的接觸反應(yīng)。反應(yīng)體系放大到1 L后,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),還原糖生成量不斷增加,柚皮苷轉(zhuǎn)化率也不斷增大,酶解反應(yīng)420 min后基本達(dá)到平衡,柚皮苷轉(zhuǎn)化率約為75%,這與20 mL反應(yīng)體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.4 酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

由圖8可知,反應(yīng)初速率-底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合方程為y=38.929x+1.9074,計(jì)算酶解反應(yīng)的Km值和最大反應(yīng)速率Vmax值,得到:Km=5.12 g/L,Vmax= 0.013 g/(L·min)。而游離柚皮苷酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的米氏常數(shù)Km=0.588 g/L,Vmax=0.011 g/(L·min)。對(duì)比固定化柚皮苷前后的Km值可以看出,柚皮苷經(jīng)固定化后Km增大很多,說明底物固定化以后,由于樹脂載體內(nèi)部的空間位阻和擴(kuò)散效應(yīng)造成酶與底物的親和性降低,反應(yīng)初速率下降。

2.5 TLC和HPLC法分析反應(yīng)產(chǎn)物

在最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí),固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化,可以得到反應(yīng)產(chǎn)物鼠李糖和普魯寧。分別在反應(yīng)前和反應(yīng)后取樣檢測(cè)驗(yàn)證其中的反應(yīng)產(chǎn)物,薄層層析結(jié)果可直觀反映出酶解反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物,結(jié)果如圖9所示。對(duì)照薄層層析圖中柚皮苷、普魯寧以及鼠李糖的顏色和位置可以看出,反應(yīng)前反應(yīng)液中只有柚皮苷,加入α-L-鼠李糖苷酶反應(yīng)一段時(shí)間后,柚皮苷逐漸水解轉(zhuǎn)化成普魯寧和鼠李糖,反應(yīng)7 h達(dá)到平衡后柚皮苷轉(zhuǎn)化率為80%,反應(yīng)液中產(chǎn)物為普魯寧和鼠李糖,還有些殘余的柚皮苷。說明該重組的α-L-鼠李糖苷酶與柚皮苷特異性反應(yīng)的產(chǎn)物中不會(huì)含有柚皮素,省去了用柚苷酶水解柚皮苷生成柚皮素的干擾,使產(chǎn)物普魯寧分離純化變得簡(jiǎn)單。

在最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí),固定化的柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)化,可以得到反應(yīng)產(chǎn)物鼠李糖和普魯寧。分別在反應(yīng)前、反應(yīng)中間和反應(yīng)后取樣留待檢測(cè)驗(yàn)證其中的反應(yīng)產(chǎn)物,HPLC結(jié)果如圖10所示。由圖10可見,加酶液前反應(yīng)液中只含有柚皮苷,加入酶液反應(yīng)后,柚皮苷在α-L-鼠李糖苷酶的催化作用下逐漸反應(yīng)轉(zhuǎn)化成了普魯寧,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),反應(yīng)液中柚皮苷量逐漸減少,普魯寧的生成量逐漸增多,反應(yīng)7 h后反應(yīng)基本達(dá)到平衡,反應(yīng)液中含有產(chǎn)物普魯寧和少量未轉(zhuǎn)化完全的柚皮苷。該檢測(cè)方法檢測(cè)不出還原糖的生成,但是可以確定反應(yīng)產(chǎn)物中沒有柚皮素的生成。

3 結(jié)論

對(duì)α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解條件進(jìn)行考察,在所考察的5種大孔吸附樹脂中,最適合用作載體的樹脂為D101-1大孔吸附樹脂。α-L-鼠李糖苷酶催化固定化柚皮苷水解的最適反應(yīng)條件為:酶用量30 U/mL,反應(yīng)溫度60 ℃,pH=4.0,底物質(zhì)量濃度2.4 g/L,振蕩速率80 r/min。在此條件下反應(yīng)420 min,柚皮苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到78%。高濃度的Mn2+、Fe2+對(duì)酶解反應(yīng)有極強(qiáng)的促進(jìn)作用。通過最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)及1 L放大試驗(yàn)證明了該優(yōu)化工藝具有良好的重現(xiàn)性。最后利用TLC法和HPLC驗(yàn)證得出,反應(yīng)完全后可得到純的普魯寧。

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