車奇濤，楊慧辛，王利麗，陳隨清，薛淑娟

（河南中醫(yī)藥大學(xué) 鄭州 450046）

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，為常用的大宗藥材之一，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。其味苦、酸、平，具有逐瘀通經(jīng)，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，利尿通淋，引血下行的功效[1]。牛膝主產(chǎn)于河南省焦作市的武陟、溫縣、沁陽一帶（古懷慶府所轄），為著名的四大懷藥之一。采收時(shí)間是影響牛膝質(zhì)量的重要因素，2015 版《中國藥典》[1]規(guī)定牛膝于冬季莖葉枯萎時(shí)采挖，文獻(xiàn)中關(guān)于牛膝的采收期研究較少，張華等[2]對(duì)不同采收期牛膝中的甾酮含量進(jìn)行研究，認(rèn)為11 月15 日所采收的牛膝甾酮含量最高，但該研究僅采用薄層色譜法對(duì)甾酮進(jìn)行了測定。牛膝中化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有皂苷類、甾酮類、多糖類、生物堿類以及黃酮類，除此之外，牛膝中還含有大量的無機(jī)元素[3-4]。藥材中的無機(jī)元素對(duì)植物本身的生理活動(dòng)和新陳代謝具有重要作用，且無機(jī)元素與藥材的藥理作用具有密切的關(guān)系。目前關(guān)于牛膝的研究主要集中在對(duì)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格等級(jí)牛膝的化學(xué)成分或藥理活性上，鮮見對(duì)不同采收時(shí)期牛膝進(jìn)行深入研究，尤其是對(duì)不同采收期牛膝中的有機(jī)化學(xué)成分和無機(jī)元素進(jìn)行全面測定，牛膝采收期的確定還有待研究。為進(jìn)一步探討牛膝藥材的最佳采收期，本研究對(duì)不同采收時(shí)間牛膝進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，首次采用有機(jī)化學(xué)成分和無機(jī)元素相結(jié)合的方法，進(jìn)行綜合分析，以便更好地控制牛膝藥材的最佳采收期，為牛膝的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（Waters 公司）；DAD 檢測器（Waters 公司）；iCAP Qc 電感耦合等離子質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；EHD-40 趕酸儀，MARS6 微波消解儀（美國CEM 公司）；BSA124S-CW 萬分之一天平（北京斯多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-QAcademic A10 超純水機(jī)（美國Millipore）；β-蛻皮甾酮對(duì)照品（上海源葉生物有限公司，批號(hào)：B21268）；25R-牛膝甾酮對(duì)照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：ST20270110MG）；25S-牛膝甾酮對(duì)照品（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：ST20260110MG）；齊墩果酸對(duì)照品（成都普菲德生物科技有限公司，批號(hào)：16060809）；葡萄糖對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)：110833-200503）；金屬單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心，標(biāo)準(zhǔn)值：1 000μg·mL-1）；水為雙蒸水，由實(shí)驗(yàn)室自制。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）及其樣品（B）、甾酮類標(biāo)準(zhǔn)品（C）及其樣品（D）HPLC圖

牛膝樣品采自于河南省武陟縣，采收日期分別為2016 年9 月28 日（Y1）、2016 年10 月18 日（Y2）、2016年10月31日（Y3）、2016年11月15日（Y4）、2016年11月26 日（Y5）、2016 年12 月6 日（Y6）、2016 年12 月19日（Y7），每個(gè)采收日期收集3個(gè)樣品，共21份樣品，所有樣品經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定為莧科植物牛膝（Achyranthes bidentata B1.）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 有機(jī)化學(xué)成分含量測定

含量測定指標(biāo)有齊墩果酸、甾酮類（β-蛻皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮）。

2.1.1 色譜條件

（1）齊墩果酸含量測定 色譜柱：Waters XBRidge C18（4.6 × 250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-水-冰乙酸（90∶10∶0.1）；流速：1 mL·min-1；檢 測波長為205 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品及樣品的HPLC 色譜圖見圖1。

（2）甾醇類含量測定色譜柱：Waters XBRidge C18（4.6 × 250 mm，5 μm），乙腈-水-甲酸（16∶84∶0.1)；流速：1 mL·min-1；檢測波長為250 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品及樣品的HPLC 色譜圖見圖1。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱量齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品3.45 mg，置10 mL容量瓶中，稱量β-蛻皮甾酮對(duì)照品3.70 mg，25R-牛膝甾酮對(duì)照品0.69 mg，25S-牛膝甾酮對(duì)照品1.20 mg，置25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至相應(yīng)刻度，搖勻后分別得濃度為0.345 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為0.148、0.0276、0.048 mg·mL-1的甾酮類混合對(duì)照品。

2.1.3 供試品溶液的制備

（1）齊墩果酸供試品溶液的制備取牛膝粉末（過三號(hào)篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入2 mol·L-1HCl 溶液25 mL，浸泡過夜。稱定重量，100℃水浴回流提取3 h，放冷，補(bǔ)足重量，過濾，濾渣用蒸餾水沖洗數(shù)次，將濾渣放入烘箱內(nèi)60℃烘干后，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中。精密加入三氯甲烷25 mL，加熱回流提30 min（提取兩次），濾過，合并濾液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL，即得。

（2）甾酮類供試品溶液的制備取牛膝粉末（過三號(hào)篩）2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，浸泡過夜。稱定重量，超聲處理30 min，放冷，補(bǔ)足重量，濾過。精密量取25 mL 濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

經(jīng)過對(duì)牛膝中4種有機(jī)化學(xué)成分的方法學(xué)考察表明齊墩果酸、25R-牛膝甾酮和25S-牛膝甾酮的線性關(guān)系良好，r 值均在0.999 8 以上；精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果均良好，其中加樣回收率試驗(yàn)RSD值分別為2.40%、2.49%、2.67%。

2.2 22種無機(jī)元素的含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確移取一定體積的各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用2%硝酸溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋，其中元素Pb，Cd，Cr，As，Cu，Li，Ti，Mn，Co，Ni，Zn，Se，Sr，Ba 稀釋為100、50、10、5、1μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度；元素Hg 稀釋為2、1、0.5、0.1、0.05 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度；元素K，Na，Ca，Mg，P，F(xiàn)e，Al 稀釋為300、200、150、100、50、20、10 μg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度；內(nèi)標(biāo)溶液為10 μg·L-1的Ge、Bi、In、Sc、Rh混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取牛膝粉末（過三號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐中，精密加入硝酸6 mL 和過氧化氫2 mL，浸泡12 h。然后將消解罐放入趕酸儀中105℃預(yù)消解20 min，冷卻至室溫。放置于微波消解儀內(nèi)，按消解程序進(jìn)行消解（樣品消解程序見表1），消解完將消解液稀釋并定容至100 mL，過濾，即得待測液。同時(shí)同法制備試劑空白溶液。

2.2.3 ICP-MS測定條件

等離子體RF 功率1 550 W，載氣流速0.80 L·min-1，霧化器流速1.181 8 L·min-1，冷卻氣流速13.94 L·min-1，霧化室溫度2.6℃，分析時(shí)間：0.6 s，等離子體冷卻水流速0.55 L·min-1，等離子體排氣壓力0.38×10-3bar，采樣深度5 mm，測量次數(shù)：3 次，掃描方式：跳峰。

表1 微波消解儀工作條件

2.2.4 方法學(xué)考察

(1) 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2.1 項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按2.2.3 項(xiàng)下的測定條件進(jìn)行測定。以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X）,峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各元素的回歸方程，線性范圍及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。線性相關(guān)系數(shù)r ＞0.999，表明線性關(guān)系良好。

(2) 精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果均良好，RSD值均小于10%，具體數(shù)值見表3。

2.3 樣品測定

不同采收時(shí)間牛膝樣品中各成分的測定結(jié)果如下，有機(jī)成分的測定結(jié)果見表4，22種無機(jī)元素的測定結(jié)果見表5。

2.4 數(shù)據(jù)處理

2.4.1 含量曲線分析

表2 各元素的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

表3 精密度、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)RSD%計(jì)算結(jié)果

表4 不同采收時(shí)間牛膝樣品4種化學(xué)成分的含量（X ±SD，n = 3）

表5 不同采收時(shí)間牛膝樣品22種無機(jī)元素的平均含量（μg·g-1）

圖2 4種有機(jī)成分（A）、宏量元素（B）、有害元素（C）、及微量元素（D、E）的含量變化曲線

對(duì)牛膝中的4 種有機(jī)成分和22 種無機(jī)元素的含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)曲線分析，結(jié)果見圖2。圖2(A)有機(jī)成分中，齊墩果酸含量在9 月28 日為最大值1.701%，隨后呈波動(dòng)狀態(tài)，分別在10 月31 日和12 月6 日達(dá)到頂值；β-蛻皮甾酮在11 月15 日達(dá)到最大值0.129 7%，之后基本保持平穩(wěn)，略有下降的趨勢；25R-牛膝甾酮含量在10 月底至12 月初基本保持平穩(wěn)，至12 月底略有下降；25S-牛膝甾酮在10 月31 日和11 月15 日含量均較高，達(dá)到0.036 8%和0.036 2%，之后隨著生長期至12月初小幅度回升后又逐漸降低。

22 種無機(jī)元素的含量變化范圍為0.01-21 851.60μg·g-1，其中K 的含量最高，其次為P、Mg、Ca，Na 含量最低。其中圖2(B)表示的是宏量元素的含量變化趨勢，可以看出，元素Ca、Na 均在10 月31 日含量達(dá)到最高值，隨后呈下降趨勢；元素Mg 在10 月中旬含量最高，之后一直下降，到11 月中旬有小幅度的回升后逐漸降低，而元素P 和K 則隨采收期先呈下降趨勢至11月底逐漸回升。這5 種元素含量均在1 000 μg·g-1以上，表明牛膝中上述5 種元素含量較高，為其主要元素。

表6 變量總體描述

微量元素的含量變化見圖2(C)、2(D)和2(E)。圖2(C)顯示的是一些有害元素的含量。國家《藥用植物及制劑出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)重金屬限量的規(guī)定：鉛(Pb) ≤5.0 mg·kg-1，鎘(Cd) ≤0.3 mg·kg-1，汞(Hg) ≤0.2 mg·kg-1，銅(Cu) ≤20.0 mg·kg-1，砷(As) ≤2.0 mg·kg-1。從圖中可以看出牛膝藥材中所有重金屬元素的含量在不同采收期均低于5 μg·g-1，低于國家規(guī)定的重金屬含量標(biāo)準(zhǔn)，提示牛膝藥材不存在重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象，符合藥材安全性評(píng)價(jià)的指標(biāo)。從重金屬元素的變化趨勢來看，其中元素Cd、Pb 均在10 月31 日含量最高，之后基本保持平穩(wěn)，相反，元素Cu 則在10 月31 日達(dá)到最低值，隨后呈逐漸增加的趨勢。元素Hg 和As則隨著采收期基本呈穩(wěn)定狀態(tài)。

圖2(D)和2(E)顯示了一些常見的微量元素含量的變化情況，其中含量較高的是元素Fe、Al、Mn，達(dá)到30μg·g-1以上。所有元素在不同采收期的含量具有一定的波動(dòng)范圍，其中元素Ni、Co、Cr、Al、Fe 基本上呈穩(wěn)定狀態(tài)，F(xiàn)e、Al 在后期有緩慢下降的趨勢；元素Li、As 均在10 月31 日達(dá)到最高值，之后逐漸降低或有小幅度回升；元素Zn 在11 月15 日含量最高，達(dá)到14.93 μg·g-1，之后逐漸下降，從12 月初又緩慢增加；元素Ba 隨采收期呈下降趨勢；元素Mn則呈波動(dòng)狀態(tài)，分別在10月初和11月底呈增加趨勢。

2.4.2 主成分分析

采用SPSS20.0對(duì)牛膝樣品中的4種有機(jī)化學(xué)成分和22 種無機(jī)元素進(jìn)行主成分分析。由表6 可以看出特征值大于1 的有5 個(gè)主成分，其累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到96.365%。采用5 個(gè)主成分對(duì)不同采收期的牛膝樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以各成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，得出地黃各類成分總因子得分值F，綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為F = 0.481 8F1+ 0.247 5F2+ 0.133 4F3+0.092 2F4+ 0.044 8F5，按綜合評(píng)價(jià)函數(shù)計(jì)算出綜合得分，其中F為綜合得分，F(xiàn)1-F5為各因子得分，其總得分與排序見表7。其中綜合得分越高，其綜合品質(zhì)越好。從表7可以看出，牛膝在11月15日采收的樣品綜合得分最高，其次10 月底及11 月下旬所采收的牛膝樣品品質(zhì)也較好。對(duì)于牛膝采收期的記載，《本草經(jīng)集注》[5]中指出：“牛膝，二月，八月，十月采根，陰干。”，因古時(shí)采取陰歷時(shí)間，對(duì)照我們現(xiàn)在的陽歷時(shí)間應(yīng)在三月、九月、十一月左右，這與我們得出的排名較為一致，即在十一月左右，10月31日及11月15日期間所采收的牛膝質(zhì)量較佳。而在懷藥產(chǎn)區(qū)，傳統(tǒng)刨挖牛膝的最佳時(shí)間是“立冬”（11月7 日左右）至“小雪”（11月22日左右）前后，最遲要在“冬至”（12 月21 日左右）前挖完。因此綜合考慮牛膝中有機(jī)成分及無機(jī)元素含量的動(dòng)態(tài)變化，牛膝藥材應(yīng)為11 月上旬進(jìn)行采挖，其品質(zhì)最好。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)成分與無機(jī)元素相結(jié)合的方法對(duì)采于河南武陟的不同采收時(shí)期的牛膝藥材質(zhì)量進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示牛膝的最佳采收期為10月底至11 月中旬，此時(shí)牛膝中甾酮類，Ca、K、Zn 等元素含量最高，綜合評(píng)價(jià)最好。此結(jié)論與傳統(tǒng)產(chǎn)地及本草古籍記載的采收時(shí)間相吻合，傳統(tǒng)產(chǎn)地一般在“立冬”（11月7日左右）至“小雪”（11月22日左右）前后采收，而《本草經(jīng)集注》[5]以“二月，八月，十月采根”為最佳時(shí)期，采集時(shí)間均在10 月底至11 月中旬。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明牛膝在10月底至11月中旬進(jìn)行采挖質(zhì)量最佳。

表7 不同采收期牛膝的主成分因子及綜合評(píng)價(jià)得分

牛膝為多年生草本，主要含有甾醇類、多糖類等化學(xué)成分，其中甾酮類是牛膝的主要有效成分，具有調(diào)節(jié)糖代謝、抗脂質(zhì)過氧化、影響細(xì)胞增殖等藥理作用[6]。在牛膝甾酮中其中以蛻皮甾酮為主發(fā)揮藥效和藥理作用，牛膝在10 月底至11 月中旬期間，其蛻皮甾酮含量最高，隨著生長時(shí)間的增長，其含量基本保持穩(wěn)定但具有逐漸降低的趨勢，到12 月底其含量最低。張華等[2]通過對(duì)不同采收期牛膝中甾酮含量的對(duì)比研究，認(rèn)為11 月15 日甾酮含量最高，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，并證明傳統(tǒng)立冬前后刨收牛膝是比較合理的。

牛膝中除了含有甾酮類成分，無機(jī)元素也是藥材中的主要成分，無機(jī)元素是生命活動(dòng)必不可少的物質(zhì)，與藥材的質(zhì)量、臨床療效、性能具有密切的關(guān)系[7-8]。近年來，許多學(xué)者以無機(jī)元素作為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，通過無機(jī)元素的測定來綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量[9-10]。牛膝具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用，與牛膝中的無機(jī)元素有著緊密的關(guān)系。管競環(huán)等[11]認(rèn)為無機(jī)元素的含量是中藥材中決定藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)，其具有含量少、作用大的特點(diǎn)，可直接作用于有機(jī)體發(fā)揮藥效。研究結(jié)果表明，牛膝在10 月底至11 月中旬元素Na、Ca、K 含量最高，其中K 能維持機(jī)體肌肉正常的韌性，促進(jìn)蛋白質(zhì)以及碳水化合物的代謝，對(duì)強(qiáng)健筋骨具有一定的促進(jìn)作用，而Ca是組成肌肉、骨骼的重要元素，與Mg、K、Na等協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉的興奮，維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)[12-13]。由此可見，這些無機(jī)元素很有可能是牛膝發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)，在一定程度上解釋了牛膝為什么具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的作用。這也為確定牛膝的最佳采收期提供了依據(jù)。除了宏量元素之外，牛膝中還含有許多微量元素，如Fe、Mn、Zn等，元素Fe隨著采收期基本呈穩(wěn)定狀態(tài)，而元素Zn 則在11 月中旬含量最高。Fe 為生命必需元素之一，是人體造血過程中必不可少的部分，具有一定的補(bǔ)血作用，劉先化等[14]通過對(duì)不同藥效中藥中的Fe 元素進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)中藥的補(bǔ)血作用與Fe元素含量呈正相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示不同采收期的牛膝中Fe 的含量均可達(dá)到150μg·g-1，表明牛膝在補(bǔ)血方面具有一定的作用，而肝為貯存血液的主要器官，這為牛膝補(bǔ)肝腎的理論提供了依據(jù)。除此之外，Zn 元素可促進(jìn)機(jī)體的生長發(fā)育，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力，缺Zn 導(dǎo)致機(jī)體生長發(fā)育緩慢，性發(fā)育緩慢，對(duì)機(jī)體的肝腎具有一定的影響，表明Zn元素也是牛膝發(fā)揮補(bǔ)肝腎作用的重要因素[15-16]。由此可以看出，牛膝中的無機(jī)元素是牛膝發(fā)揮藥效的重要基礎(chǔ)，以無機(jī)元素的含量作為牛膝質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)，確定牛膝的最佳采收期，具有一定的可行性。

中藥材成分復(fù)雜，其質(zhì)量受到環(huán)境、產(chǎn)地、加工等因素的影響，本研究從有機(jī)化學(xué)成分和無機(jī)元素方面入手，研究了不同采收時(shí)期牛膝中4 種有機(jī)化學(xué)成分和22種元素的含量變化特征，通過綜合分析牛膝中主要藥效成分的變化特征確定了牛膝的最佳采收期，為牛膝藥材采收時(shí)間的確定提供了理論依據(jù)。