吳金訓(xùn)

【摘要】 目的：研究并分析PDK-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義，為胃癌的治療提供新的思路。方法：選取2010年1月-2012年1月于筆者所在醫(yī)院確診的82例胃癌患者的癌組織作為觀察組，另選取82例健康體檢人群正常胃黏膜組織作為對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法及免疫組化染色法檢測PDK-1蛋白在GC組織和正常胃黏膜組織中的表達(dá)水平，并分析PDK-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與患者各臨床病理及PDK-1表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系。結(jié)果：胃癌組織中的PDK-1表達(dá)水平顯著性高于正常組織（t=80.36，P<0.01）;觀察組PDK-1高表達(dá)率顯著高于對(duì)照組;PDK-1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平與胃癌患者性別無相關(guān)性（字2=0.001 1，P=0.93），而PDK-1蛋白與胃癌TMN分期、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)性，且TNM分期越高、腫瘤≥35 mm、分化程度越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，PDK-1高表達(dá)率越高;PDK-1低表達(dá)組5年生存率及生存期均明顯高于PDK-1高表達(dá)組（字2=8.713，t=16.108，P<0.01）。結(jié)論：胃癌組織中PDK-1表達(dá)顯著性高于正常胃黏膜組織;PDK-1促進(jìn)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展;PDK-1高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。PDK-1可能作為胃癌的候選基因和潛在的胃癌生物標(biāo)志物，深入研究PDK-1具有重要的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】 胃癌 PDK-1 預(yù)后分析 臨床意義

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.29.030 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2019）29-00-03

[Abstract] Objective： To study and analyze the expression and clinical significance of PDK-1 protein in gastric cancer， and provide new ideas for the treatment of gastric cancer. Method： The cancer tissues of 82 patients with gastric cancer diagnosed in the hospital from January 2010 to January 2012 were selected as the observation group. The normal gastric mucosa of 82 healthy subjects was selected as the control group. The expression levels of PDK-1 protein in GC tissues and normal gastric mucosa were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and immunohistochemical staining. The relationship between the expression level of PDK-1 protein in gastric cancer tissues and clinical pathology and prognosis of patients were analyzed. Result： The expression of PDK-1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues （t=80.36， P<0.01）. The high expression rate of PDK-1 in the observation group was significantly higher than that in the control group. The expression level of PDK-1 protein in gastric cancer tissues was not correlated with the gender of gastric cancer patients （字2=0.001 1， P=0.93）， and PDK-1 protein were significantly correlated with gastric cancer TMN stage， differentiation degree， lymph node metastasis， and the higher the TNM stage， Tumor ≥35 mm， the higher the degree of differentiation， lymph node metastasis， the higher expression rate of PDK-1. The 5-year survival rate and survival time of PDK-1 lower expression group were significantly higher than those of PDK-1 higher expression group （字2=8.713， t=16.108， P<0.01）. Conclusion： The expression of PDK-1 in gastric cancer tissues is significantly higher than that in normal gastric mucosa. PDK-1 promotes the occurrence and development of gastric cancer. The high expression of PDK-1 is associated with poor prognosis of gastric cancer patients. PDK-1 may be a candidate gene for gastric cancer and a potential biomarker for gastric cancer. The in-depth study of PDK-1 has important clinical significance.

[Key words] Gastric cancer PDK-1 Prognosis analysis Clinical significance

First-authors address： Lianjiang County Hospital， Lianjiang 350500， China

胃癌是世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤，是全球癌癥死亡率的第二大原因[1]。在中國每年大約有一半的胃癌發(fā)生率和死亡率。在大多數(shù)情況下，胃癌已經(jīng)發(fā)展到晚期，并且在診斷時(shí)已經(jīng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移，因此胃癌的5年生存率較低。鑒定新的潛在的胃癌生物標(biāo)志物和高風(fēng)險(xiǎn)因子，以及闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有非常重要的臨床意義[2-3]。近年來，越來越多研究表明，磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶-1（PDK1）的異常激活與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌[4]。PDK-1基因的靶向抑制可顯著抑制這些癌癥的細(xì)胞生長[5]。然而，PDK-1基因的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及在癌變中扮演了怎樣的角色尚不清楚。筆者研究了胃癌患者腫瘤組織中的PDK-1表達(dá)，并分析了PDK-1基因的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性。結(jié)果表明PDK-1可能作為胃癌的候選靶基因和潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～70周歲，性別不限;（2）觀察組患者經(jīng)胃鏡及病理組織學(xué)確診為胃癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有嚴(yán)重的精神障礙及神經(jīng)系統(tǒng)病變;（2）肝腎功能不全，其他惡性腫瘤、膽汁淤積;（3）嚴(yán)重高血壓疾病。于2010年1月-2012年1月筆者所在醫(yī)院收治的82例胃癌患者為研究對(duì)象，取患者的胃癌組織作為觀察組，82例正常體檢人群的正常胃黏膜組織作為對(duì)照組。82例胃癌患者中，男40例，女42例，年齡56～81歲，平均（58.3±9.6）歲，病程5～8年，平均（6.73±2.10）年。對(duì)照組男43例，女39例，年齡55～80歲，平均（58.6±9.2）歲。兩組性別、年齡等一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)筆者所在醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有患者（或患者直系親屬）均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

超凈工作臺(tái)（蘇州安泰）、PDK-1 Elisa 試劑盒（上海瓦蘭生物）、全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（北京普朗）、兔抗人PDK-1多克隆抗體（上海信裕生物）、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木素染色劑（蓋德化工）。

1.3 Elisa法測定PDK-1蛋白含量

將少量組織塊置于1.5 ml離心管中，加入500 μl含PMSF的強(qiáng)RIPA裂解液，先用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，接著用1 ml槍頭不斷地吹打吸取，用勻漿器打碎組織，最后用超聲儀進(jìn)行超聲裂解;將離心管置入4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心25 min，取上清分裝于1.5 ml離心管中并置于-80 ℃保存，采用Elisa法測定上清中PDK-1的含量。

1.4 免疫組化法測定PDK-1的表達(dá)水平

胃癌組織和正常樣品在4%中性磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定并包埋在石蠟中，在脫蠟后，將內(nèi)源性過氧化物酶在3%的H2O2中封閉20 min。將組織切片切成5 mm厚，用于隨后對(duì)PDK1蛋白的免疫組織化學(xué)染色。通過將樣品在10 mmol檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中于95 ℃加熱60 min來進(jìn)行抗原修復(fù)。在室溫下用Block Ace處理30 min后，將PDK-1按1∶500的稀釋度加到切片上，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育30 min，加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物，切片用蘇木精復(fù)染，封片。免疫染色由兩位不同的病理學(xué)家評(píng)估。PDK-1蛋白表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。免疫組織化學(xué)染色根據(jù)染色強(qiáng)度的視覺分級(jí)為低（+）或高（+++）。

1.5 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

均按照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)分類，TMN分期按照UICC標(biāo)準(zhǔn)，病理特征按照胃癌的Lauren分型來確定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析用SPSS 18.0系統(tǒng);計(jì)量資料以（x±s）表示，并采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn);PDK1蛋白水平與胃癌患者預(yù)后采用Kaplan-Meier生存曲線分析，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDK-1在胃癌組織及正常組織中的表達(dá)水平比較

胃癌組PDK1蛋白表達(dá)水平為（63.57±5.12） ng/g，高于正常組織的（13.48±3.28） ng/g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=74.6，P<0.01）。

2.2 PDK-1在觀察組和對(duì)照組中表達(dá)情況比較

PDK-1蛋白在胃癌組織和正常組織中的高表達(dá)率分別為87.8%、56.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=20.42，P<0.01），見表1。

2.3 PDK-1表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

PDK-1表達(dá)與性別無相關(guān)性（P>0.05），而與腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN分期顯著相關(guān)（P<0.01），見表2。

2.4 PDK-1蛋白表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后

PDK-1低表達(dá)組5年生存率與PDK-1高表達(dá)組5年生存率（90.0% vs 50.0%）及PDK-1低表達(dá)組生存期與PDK-1高表達(dá)組生存期[（54.2±2.14）個(gè)月] vs [（33.8±2.96）個(gè)月]差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=8.713，t=16.108，P<0.01），見圖1。

3 討論

胃癌是最致命的惡性腫瘤之一，超過50%的晚期惡性腫瘤患者在確診時(shí)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然胃癌的臨床治療取得了進(jìn)展，然而，這種惡性腫瘤的耐藥性和發(fā)展迅速性在某種程度上阻止了胃癌的治療效果。在目前的研究中，發(fā)現(xiàn)PDK-1在胃癌組織和相鄰的非腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在顯著差異。另外，發(fā)現(xiàn)PDK-1的表達(dá)與患者存活率高度相關(guān)，PDK-1高表達(dá)患者術(shù)后生存率顯著低于PDK-1表達(dá)的患者。筆者認(rèn)為PDK-1可能在胃癌的發(fā)展中起重要作用，可以作為胃癌的潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。

研究證明，PDK-1是絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于蛋白激酶家族的成員，其催化結(jié)構(gòu)域與cAMP依賴性蛋白激酶1以及蛋白激酶C有同源性[6-7]。作為磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT/PKB）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mlOR）信號(hào)傳導(dǎo)通路的第一個(gè)節(jié)點(diǎn)，PDK-1涉及一系列磷酸化過程，PDK-1的組成型表達(dá)通常由其他激酶調(diào)節(jié)，然后在第308位蘇氨酸處進(jìn)行AKT的磷酸化，AKT激活所必需的。確實(shí)，胃癌基因突變多方面的研究已經(jīng)暗示了這一點(diǎn)，PI3K/Akt/mTOR通路作為胃癌發(fā)展過程的重要的一部分[8-10]。據(jù)報(bào)道，74%和78%的胃腫瘤表現(xiàn)出Akt和磷酸化Akt（p-Akt）表達(dá)水平的升高[11-12]。該p-Akt在促進(jìn)各種分子功能，如細(xì)胞周期進(jìn)展和血管生成已經(jīng)得到廣泛的研究。血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要組成部分，它可以募集新的血管，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位進(jìn)入血液。筆者的數(shù)據(jù)顯示PDK-1的表達(dá)和臨床病理參數(shù)及胃癌的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，暗示PDK-1發(fā)揮作用在胃癌的發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用。總之，筆者研究了PDK-1在胃腫瘤患者和健康體檢者中的表達(dá)，隨后研究了其表達(dá)水平與患者預(yù)后和生存之間的關(guān)系。在目前的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)胃癌組織和健康體檢者的PDK-1表達(dá)存在顯著差異;此外，筆者發(fā)現(xiàn)PDK-1的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、分化;PDK-1的高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，筆者推測PDK-1可能在胃癌的發(fā)展中起重要作用，并且有望成為胃癌診斷的生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)

[1]靳楓，余少康，王樹濱，等.miR-424在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2019，16（7）：126-129.

[2]陳素梅，李芳芳，張麗萍.胃癌癌前病變臨床分析[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（35）：116-118.

[3]邵長明，邵欽樹.胃癌組織中microRNA-224陽性表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)性分析[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2016，14（27）：1-3.

[4]申力，郝友進(jìn)，羅錢春，等.蔥蠅PDK1基因的克隆及生物信息學(xué)分析[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，31（1）：30-36.

[5]王永峰，高恒瑞，張紅鴿，等.3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1小干擾RNA對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2016，33（2）：331-333.

[6]張穎，孫志鵬，余春開，等.胃癌患者癌組織中PDK-1蛋白表達(dá)水平及其臨床意義[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2018，21（3）：298-303.

[7]劉田田，畢經(jīng)旺.3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療中的作用[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2016，43（4）：285-288.

[8]張俊萍，趙一，梁瑞峰，等.化瘀解毒方對(duì)過表達(dá)PDK1和Akt人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（5）：1036-1039.

[9]英舟，萬義增，陳素賢.miR-138靶向調(diào)控PDK1基因抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞侵襲[J].腫瘤防治研究，2016，43（5）：340-344.

[10]于婧，王鳳琴，姚文娟，等.結(jié)直腸癌組織中PDK1、Bcl-2、survivin 表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（30）：34-36.

[11]宋世鐸，周健，何宋兵，等.miR-375和PDK1在胰腺癌組織中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性[J].腫瘤防治研究，2013，40（8）：728-732.

[12]李蘇霞，何釬鋮，陳素秀.PDK1對(duì)肺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J].中國病理生理雜志，2018，34（2）：225-231.

（收稿日期：2019-08-26） （本文編輯：何玉勤）