宮鵬超 李艷蘭 孔翠翠 田 昕*

(1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所二室，沈陽 110001；2. 中國醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院中心試驗室，沈陽 110001)

我國是腫瘤高發(fā)國家，胃癌是消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期階段。晚期胃癌的治療方法主要以化學藥物治療為主，但是在臨床藥物治療過程中，腫瘤細胞會逐漸產(chǎn)生以抗凋亡為主要特征的耐藥性[1]，使抗腫瘤藥物失去對其的殺傷作用。然而，在近年研究[2]中顯示，當傳統(tǒng)的凋亡途徑受到抑制時，細胞會通過程序性壞死這種后備的細胞死亡途徑引起細胞的死亡。蟾蜍靈(Bufalin)的抗癌作用在近年來成為了研究熱點，其分子式為C24H34O4，相對分子質(zhì)量為386.5，是從中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物中提取的主要成分之一。蟾蜍靈通過凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的觀點被大多數(shù)研究[3-4]所認同。但是在回顧既往研究[4]成果時發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生非凋亡性死亡。本研究將蟾蜍靈(Bufalin)作用于胃癌SGC-7901細胞，探討蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞發(fā)生程序性壞死的機制，為蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌細胞死亡的機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌SGC-7901細胞株由中國醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)院腫瘤研究所二室提供。胎牛血清(美國Mediatech公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，蟾蜍靈、MTT、DMSO(二甲基亞砜)(美國Sigma公司)，4，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，碘化丙啶(propidium iodide,PI)(北京索萊寶科技有限公司)，ECL發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司)，受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1， RIP1)抗體(英國Abcam公司)，HRP標記的山羊抗兔IgG抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，RIP1蛋白抑制劑(necrostain-1，NEC-1)。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

將人胃癌SGC-7901細胞培養(yǎng)在含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，細胞在37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。對照組的SGC-7901細胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，不加任何干預(yù)因素(蟾蜍靈濃度為0)。實驗組的SGC-7901細胞按照實驗?zāi)康募尤氩煌瑵舛鹊捏蛤莒`(50、100、150、200 nmol/L)。兩組細胞繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率

每孔100 μL細胞懸液，將細胞以1×105/mL的密度種植在96孔板中，待次日待細胞處于對數(shù)生長期時，對照組中加入培養(yǎng)液，實驗組中加入不同濃度蟾蜍靈繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間。96孔板中每個濃度設(shè)6個平行孔。處理時間結(jié)束后，在每孔中加入5 g/L的MTT 20 μL，在37 ℃、5% (體積分數(shù))CO2的條件下孵育4 h后吸除孔內(nèi)上清液，加入150 μL DMSO震蕩10 min，使沉淀充分溶解。酶標儀490 nm測定吸光度。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選擇蟾蜍靈濃度相同時，24、48 h兩組差異較大的濃度作為后續(xù)實驗組的蟾蜍靈濃度值。

1.2.3 DAPI染色法觀察細胞核形態(tài)

將處于對數(shù)生長期細胞按適宜密度接種于6孔板中，對照組加入RPMI 1640培養(yǎng)液，實驗組加入蟾蜍靈(100 nmol/L)處理24、48 h，待處理時間結(jié)束后，吸除對照組及實驗組孔內(nèi)液體，預(yù)冷PBS洗滌細胞，室溫下固定15 min，吸除固定液并加入少量DAPI染色液，室溫放置3～5 min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)輕柔洗滌細胞5 min，3次，直接在熒光顯微鏡下觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.2.4 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

離心收集對照組及實驗組(100 nmol/L，24、48 h)細胞，在細胞沉淀中加入2.5%(體積分數(shù))戊二醛，4 ℃固定細胞沉淀6～12 h后吸出固定液，加入預(yù)冷PBS放置4 h，加入1%(體積分數(shù))鋨酸固定1 h，PBS洗滌細胞后經(jīng)過脫水、包埋、修塊、切片、染色等步驟，透射電鏡觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞壞死率

將細胞按適宜密度種植于6孔板中，次日待細胞處于對數(shù)生長期時，對照組更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，實驗組1加入蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實驗組2經(jīng)NEC-1(20 μmol/L)預(yù)處理2 h后加入蟾蜍靈(100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。處理時間結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶收集細胞，PBS洗滌細胞沉淀，1 000 r/min離心5 min，3次，加入5 μL PI，混勻細胞沉淀后流式細胞儀檢測并記錄結(jié)果。

1.2.6 Western blotting法檢測RIP1蛋白表達量

用BCA蛋白定量試劑盒確定收集的兩組細胞總蛋白濃度，確定濃度的樣品煮沸后于-80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳法10%(質(zhì)量分數(shù))分離膠分離，恒流濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜或室溫孵育2 h，洗膜后二抗室溫孵育2 h，ECL法顯色。Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 蟾蜍靈對細胞活性的影響

蟾蜍靈對SGC-7901細胞活性的抑制作用有明顯劑量依賴性，隨著蟾蜍靈濃度的升高細胞活性呈現(xiàn)下降趨勢。蟾蜍靈在24 h和48 h的IC50分別為(111.55±7.25)nmoL/L和(90.51±2.50)nmol/L。蟾蜍靈處理細胞24、48 h時，實驗組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。藥物濃度相同情況下，48 h與24 h實驗結(jié)果相比，除50 nmol/L濃度組差異無統(tǒng)計學意義外，其余濃度組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 不同濃度蟾蜍靈處理 SGC-7901細胞24、48 h后對細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Bufalin on cell viability after 24 h and 48 h treatment of SGC-7901 cells

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vs24 h at the same concentration.

2.2 DAPI染色法觀察細胞核形態(tài)

RPMI 1640處理對照組， 蟾蜍靈(100 nmol/L)處理對照組，處理時間結(jié)束后(24 h、48 h)，細胞核沒有出現(xiàn)明顯凋亡特征性改變，與對照組相比并無明顯變化，詳見圖2。

2.3 透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

實驗組經(jīng)蟾蜍靈(100 nmol/L)處理24 h后觀察發(fā)現(xiàn)，細胞膜連續(xù)性出現(xiàn)破壞，并伴有大量細胞內(nèi)空泡的產(chǎn)生，細胞核無明顯改變。蟾蜍靈(100 nmol/L)處理細胞48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，細胞膜完全崩解，細胞核未見明顯改變，詳見圖3。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞壞死率

實驗組細胞經(jīng)不同濃度蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)處理細胞48 h后，隨著藥物濃度的逐漸升高，細胞壞死率由對照組的4.52%±0.84% 增高至實驗組的8.88%±1.32%、20.26%±2.70%、41.5%±1.77% 和48.95%±2.92%，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01)(圖4)。細胞經(jīng)RIP1蛋白抑制劑NEC-1預(yù)處理2 h后，再用蟾蜍靈(100 nmol/L)處理細胞48 h，細胞壞死率由未經(jīng)NEC-1預(yù)處理時的24.36%±2.14% 降低至16.21%±4.28%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。

圖2 蟾蜍靈處理SGC-7901細胞24、48 h后對細胞核形態(tài)的影響Fig.2 Effect of Bufalin on the morphology of nuclear changes after 24 and 48 h treatment of SGC-7901 cells

圖3 蟾蜍靈處理SGC-7901細胞24、48 h后細胞形態(tài)學改變(10 000×)Fig.3 Morphological changes of cells treated with Bufalin after 24 and 48 h in SGC-7901 cells

圖4 不同濃度蟾蜍靈處理SGC-7901細胞48 h后對細胞壞死率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of bufalin on the necrosis rate of SGC-7901 cells after 48 h

2.5 Western blotting法檢測RIP1蛋白的表達

用不同濃度蟾蜍靈(50、100、150、200 nmol/L)處理SGC-7901細胞48 h后，與對照組相比，蟾蜍靈濃度分別為100、150、200 nmol/L的實驗組細胞RIP1蛋白的表達明顯增加。50 nmol/L濃度組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，其余濃度組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見圖6。

圖5 RIP1蛋白抑制劑NEC-1處理后對細胞壞死率的影響Fig.5 Effect of RIP1 protein inhibitor NEC-1 on cell necrosis

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsBufalin at the same concentration and time；NEC-1:necrostain-1.

3 討論

胃癌在全世界及我國范圍內(nèi)均位于惡性腫瘤死亡前列。在臨床治療過程中，晚期胃癌患者占較大比重，而晚期胃癌的治療手段主要以化學藥物治療為主。雖然現(xiàn)階段的臨床藥物治療針對的靶點與治療機制并不相同，但都是以誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡為主，從而達到殺死腫瘤細胞的目的[5-6]。但是，在實際臨床治療過程中，腫瘤細胞對藥物產(chǎn)生凋亡抵抗的問題，是臨床治療過程中一個難以克服的障礙[7]。

圖6 不同濃度蟾蜍靈處理SGC-7901細胞48 h后對RIP-1表達量的影響Fig.6 Effect of different concentrations of Bufalin on the expression of RIP-1 in SGC-7901 cells after 48 h treatment

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

在2005年Degterev等[8]首次提出了壞死性凋亡(necroptosis)這一概念。程序性壞死發(fā)生時的形態(tài)學改變是以壞死樣的改變?yōu)橹饕卣?，細胞膜完整性的破壞和細胞器的腫脹發(fā)生于程序性壞死的早期，并且在局部會伴有嚴重的炎性反應(yīng)[9-10]，同時，又受到特定的細胞信號通路調(diào)控，是一種不依賴于凋亡信號通路中Caspase信號分子調(diào)控的有序的細胞死亡過程。程序性壞死途徑可由各種因素所激活，而由腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)這種傳統(tǒng)的多效性的細胞因子所誘導(dǎo)的“死亡受體-RIP1/RIP3-MLKL-PGAM5”程序性壞死途徑研究的最為深入[11-13]。在該信號通路中，能夠傳遞死亡信號的必要條件，就是形成RIP1、RIP3和MLKL所組成的壞死復(fù)合物(necrosome)[14-15]，而形成復(fù)合物的重要啟動分子就是RIP1。隨著RIP1的活化，RIP3、MLKL及PGAM5等下游分子相繼活化。因此，本研究通過MTT、流式細胞術(shù)檢測壞死率、透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)和Western blotting法檢測等一系列方法，探討蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞程序性壞死的可能機制。

MTT法檢測細胞活性常用于研究藥物對細胞增生的影響[16]。本研究MTT實驗結(jié)果表明，蟾蜍靈對SGC-7901細胞生長的抑制作用呈時間和劑量的依賴性。DAPI染色后熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)是否發(fā)生改變，可以初步判斷細胞是否發(fā)生凋亡。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，細胞經(jīng)蟾蜍靈處理后并不會發(fā)生典型的凋亡性改變，說明蟾蜍靈誘導(dǎo)SGC-7901細胞死亡還可能通過其他途徑。細胞發(fā)生程序性壞死時在形態(tài)學上的改變主要以細胞壞死的特點為主。透射電鏡是觀察細胞超微結(jié)構(gòu)改變的金標準。透射電鏡結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，實驗組中細胞膜與胞質(zhì)的變化最為明顯，表明細胞死亡的方式并不是凋亡，而是壞死。隨后，筆者通過PI染色后流式細胞儀檢測這種檢測細胞壞死的常用手段發(fā)現(xiàn)，隨著蟾蜍靈的濃度升高，細胞的壞死率隨之升高，呈明顯的劑量依賴性。RIP1特異性抑制劑NEC-1可以使細胞壞死率降低，進一步證明了蟾蜍靈可以使SGC-7901細胞發(fā)生程序性壞死。Western blotting法檢測結(jié)果表明，隨著蟾蜍靈濃度的增加，程序性壞死關(guān)鍵分子RIP1的表達量隨著蟾蜍靈濃度的升高而逐漸升高。

綜上所述，本研究以胃癌SGC-7901細胞作為模型，來評估蟾蜍靈誘導(dǎo)的程序性壞死。實驗結(jié)果證明蟾蜍靈可以通過RIP1介導(dǎo)的程序性壞死途徑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細胞死亡。本研究為蟾蜍靈誘導(dǎo)胃癌細胞死亡的機制提供新的理論依據(jù)。