李敏娜*

(首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京 100069)

過渡金屬配合物具有與DNA鍵合的特性，在DNA構(gòu)象探針、化學(xué)藥物治療藥物先導(dǎo)和細(xì)胞顯像劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值[1-6]。因此，具有高選擇性的DNA結(jié)合特性的過渡金屬配合物的設(shè)計(jì)和合成近年來一直是人們研究的熱點(diǎn)。多吡啶合釕(Ⅱ) 配合物，尤其是二-(1,10-鄰菲羅啉)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine,[Ru(phen)2(dppz)]2+}，詳見圖1，及其衍生物由于其優(yōu)良的DNA“光開關(guān)”能力(在純水溶液中不發(fā)光，但在水中加入DNA后，配合物的主配體dppz插入DNA堿基對(duì)中，吩嗪上的N原子脫離溶劑H2O的氫鍵作用，發(fā)出強(qiáng)光[7])而備受關(guān)注。研究[8]表明，與DNA作用的藥物分子具有抗腫瘤活性，有兩點(diǎn)至關(guān)重要：一是與DNA較強(qiáng)的鍵合力，二是從DNA解離出來具有較慢的解離速率。據(jù)報(bào)道[9-10]通過單鍵連接兩個(gè)[Ru(phen)2(dppz)]2+的半剛性雙核配合物四-(1,10-鄰菲羅啉)-二聯(lián)吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪基合二釕(Ⅱ){diruthenium tetra(phenanthroline)-dipyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine，[bidppz(phen)4Ru2]4+}解離DNA的速率非常慢，類似于具有抗癌活性的天然產(chǎn)物諾加霉素。雙核配合物具有慢的解離速率是由于單核Ru部分較大空間構(gòu)型，通過或解離DNA時(shí)需要至少一個(gè)堿基對(duì)瞬間打開或堿基對(duì)堆疊一起，空間位阻較大，同時(shí)也導(dǎo)致了配合物對(duì)DNA序列的選擇性[10]。隨后科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)并合成了一系列雙核類似物，并發(fā)現(xiàn)輔助配體的親疏水性、橋聯(lián)配體靈活性的大小也會(huì)影響DNA解離速率[11-14]。雙核配合物雖然部分可獲得較慢解離DNA速率，但由于相對(duì)分子質(zhì)量過大，反應(yīng)中易形成沉淀，影響其與核酸作用。假設(shè)對(duì)于單核配合物來講，如果在主配體dppz長(zhǎng)軸上引入大的取代基，當(dāng)其插入DNA堿基對(duì)時(shí)，較大的空間位阻勢(shì)必也能降低配合物解離DNA的速率，避免相對(duì)分子質(zhì)量過大導(dǎo)致的后果?；谝陨峡紤]，早期本課題組就合成了一系列單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物[15-16]，尤其是芳基取代吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪配體的10和13位[16]。令人驚喜的是dppz配體含有噻吩取代的配合物與DNA結(jié)合與解離的速度都很慢，屬于嵌插入結(jié)合方式，這是繼雙核配合物[11]后第二個(gè)能夠以嵌插入模式結(jié)合DNA的釕配合物。而二苯基取代的類似物似乎只是取代基中的一個(gè)苯基部分插入DNA，從而更快的解離。在這些成果的鼓舞下，本課題組繼而設(shè)計(jì)并合成了3種以2,2′-聯(lián)吡啶(2,2′-bipyridine,bpy)為輔助配體，主配體dppz的10, 13位分別為噻吩、苯及呋喃的單核二-(2,2′-聯(lián)吡啶)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(2,2′-bipyridyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine,[Ru(bpy)2(dppz)]2+}衍生物。結(jié)果表明3種配合物均以部分插入或溝槽結(jié)合與DNA作用，說明輔助配體的性質(zhì)在DNA結(jié)合模式也起著重要的作用[17]。

圖1 配合物二-(1,10-鄰菲羅啉)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of complex ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine

由于嵌插入方式是一個(gè)不尋常的DNA結(jié)合模式，顯示出極其緩慢的動(dòng)力學(xué)，它是細(xì)胞毒性的一個(gè)重要特征，該方式作用的化合物應(yīng)是新的基于與DNA結(jié)合藥物的模型化合物。正如上面提到的，這種結(jié)合方式的單核釕配合物目前報(bào)道的僅僅是10和13位含有二噻吩基取代dppz配體、鄰菲羅啉為輔助配體的配合物。為此，進(jìn)一步設(shè)計(jì)以鄰菲羅啉輔助配體，dppz配體10, 13位取代的新的釕配合物并探索分子結(jié)構(gòu)與DNA結(jié)合特性之間的關(guān)系具有十分重要的意義。因此，筆者設(shè)計(jì)并合成了新的單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物方案，為二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(2-噻吩基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)[ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine， Ru-T];二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(2-呋喃基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ)[ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine， Ru-F];二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(4,7-苯并噻吩基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine， Ru-BT};二-(1,10-鄰菲羅啉)-10,13-二(4,7-苯并呋喃基)-吡啶類(3,2-a:2′-3′-c)吩嗪合釕(Ⅱ){ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c，phenazine， Ru-BF}。為了研究芳香基上雜原子范德華半徑及電子分布對(duì)釕配合物與DNA作用的影響，與前期報(bào)道的10,13-二(2-噻吩) 取代dppz配體的 [Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T)進(jìn)行對(duì)比，設(shè)計(jì)出由呋喃取代dppz配體的目標(biāo)分子Ru-F。為了探討取代基的大小對(duì)釕配合物與DNA作用的影響，分別對(duì)比Ru-T和Ru-F，設(shè)計(jì)出dppz配體分別由2-苯并噻吩和2-苯并呋喃取代的目標(biāo)分子Ru-BT和Ru-BF。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

本論文所用的溶劑均為分析純，購(gòu)于北京化工試劑公司。除無水乙醇外均直接用于實(shí)驗(yàn)中。氘代DMSO，氘代氯仿、2-呋喃硼酸、四-(三苯基磷)合鈀(0)催化劑均從百靈威科技有限公司購(gòu)置。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Laborota 4000)購(gòu)自德國(guó)Heidolph Instruments公司；磁共振光譜儀上(500 MHz)、高分辨質(zhì)譜儀 (Micro-TOF-Q)購(gòu)自美國(guó)Bruker公司；紫外-可見分光光度計(jì) (UV-2550)購(gòu)自日本島津公司。

中間體二氯-二-(1.10-鄰菲羅林)合釕(Ⅱ){ruthenium di-(1,10-phenanthroline)dichloride，cis-[Ru(phen)2Cl2]}[18]，二氯-二-(1.10-鄰菲羅林)-1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮合釕(Ⅱ){ruthenium di(1,10-phenanthroline)-1,10-phenanthroline-5,6-dione-dichloride),[Ru(phen)2(pq)]Cl2}[19]和4,7-二(2-噻吩基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole，T], 4,7-二(2-苯并(b)噻吩基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-benzo(b)thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole，BT]和4,7-二(2-苯并(b)呋喃基-苯并噻二唑[4,7-bis(2-benzo(b)furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole，BF] 根據(jù)文獻(xiàn)[16-17]的制備程序得到。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無水乙醇的干燥

將200 mL 99%(體積分?jǐn)?shù))的無水乙醇置于500 mL 圓底燒瓶中，加入5 g 鎂條，回流4 h后，蒸餾，收集78～80 ℃餾分，待用。

1.2.2 4,7-二(2-呋喃基)-苯并噻二唑[4,7-bis(2-furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole， F]的合成

F的制備方法和筆者前期報(bào)道[16]的4,7-二(2-噻吩基)-苯并噻二唑的合成相同，即是通過Suzuki 偶聯(lián)反應(yīng)。4,7-二溴苯并(1,2,5)噻二唑的混合物(88 mg，0.3 mmol)，2-呋喃硼酸(111 mg，1 mmol)、碳酸鉀(414 mg，3 mmol)和Pd(PPh3)4(47 mg，0.04 mmol)在二氧六環(huán)和水的混合溶劑 (體積比為4∶1, 8 mL)中，N2保護(hù)下回流。薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程(硅膠板，石油醚作展開劑，Rf= 0.3)。溶液的顏色由紅色變?yōu)樽厣?，最后變成橙色。待原料消失，停止反?yīng)。將反應(yīng)液冷卻至室溫，加入40 mL 水，然后采用二氯甲烷(3×10 mL)萃取。得到的萃取液經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，得到的溶液在減壓下旋干。然后以石油醚為洗脫劑，在硅膠柱上進(jìn)行分離，得到橙黃色固體32 mg，產(chǎn)率40%。1H NMR δH(500 MHz, CDCl3) 6.66 (2H, J=2.0 Hz, d), 7.62 (s, 2H), 7.72 (2H, J=3.0 Hz, d), 8.08 (s, 2H);13C NMR (500 MHz, CDCl3) 112.16, 112.48, 121.80, 123.52, (142.80), 150.017, 151.33; TOF-MS 269.043 5 ([M+H+]), 相對(duì)分子質(zhì)量269.037 9。

1.2.3 3,6-二(2-呋喃基)-1,2-二胺基苯的合成

3,6-二(2-呋喃基)-1,2-二胺基苯的制備方法參考Dasilveria等[20]報(bào)道的3,6-二芳香基鄰苯二胺的合成。4,7-二呋喃苯并(1,2,5)噻二唑(0.2 mmol)，硼氫化鈉 (11 mg，0.3 mmol)和CoCl2·6H2O (10 mg，0.04 mmol)溶解在5 mL干燥的乙醇中。在氬氣保護(hù)下將得到的懸浮液回流10 min。溶液變成無色并且有黑色固體Co2B析出，同時(shí)有H2S氣體放出。反應(yīng)混合物冷卻至室溫，過濾。得到的濾液加入15 mL水，接著用乙醚萃取(3×10 mL)。萃取液組合在一起，加入無水Na2SO4干燥，減壓下蒸干溶劑即得到無色固體即為目標(biāo)產(chǎn)物。由于鄰苯二胺類似物在空氣中不穩(wěn)定，為避免其快速分解，通常立即將其應(yīng)用于下步的反應(yīng)中，無表征數(shù)據(jù)。幸運(yùn)的是，本課題組對(duì)得到的固體快速置于經(jīng)K2CO3過濾的氘代氯仿中，經(jīng)磁共振儀得到了3,6-二呋喃基鄰苯二胺的磁共振圖譜。1H NMR δH(500 MHz, CDCl3) 6.55 (s, 2H), 6.63 (2H, J=3.0 Hz, d), 7.08 (s, 2H), 7.55 (s, 2H);13C NMR (500 MHz, CDCl3) 106.92, 111.43, 116.74, 118.28, 132.63, 141.47, 153.65; TOF-MS 241.1019 ([M+H+]),相對(duì)分子質(zhì)量 241.0972.

1.2.4 dppz配體的10,13-位由芳香基取代的幾種單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T，Ru-F，Ru-BT和Ru-BF)的合成

幾種目標(biāo)配合物的合成方法相同。制備過程如下： 3,6-二芳香基鄰苯二胺類中間體(0.05 mmol)，[Ru(phen)2(pq)]Cl2(0.025 mmol，19 mg)溶解在1 mL乙腈中，加入一滴乙酸。反應(yīng)液在暗處、氬氣保護(hù)下回流10 min，冷卻至室溫。溶液顏色由深棕色變?yōu)樯罴t色。向反應(yīng)液中加入飽和NH4PF6水溶液1 mL，發(fā)現(xiàn)橙紅色沉淀，過濾，先后用水(3 × 5 mL)和乙醚(3 × 5 mL)洗滌，真空干燥。得到的固體經(jīng)氧化鋁柱層析純化，乙腈為洗脫劑，得到橙紅色固體為目標(biāo)產(chǎn)物的六氟磷酸鹽形式。將六氟磷酸鹽的產(chǎn)物溶于2 mL丙酮中，得到紅色溶液，加入少量氯化銨，得到橙紅色沉淀，過濾，先后用丙酮(3 × 3 mL)和乙醚(3 × 3 mL)洗滌，真空干燥。得到了目標(biāo)產(chǎn)物的氯鹽形式。每個(gè)單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物的表征數(shù)據(jù)如下。

1.2.5 芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)及對(duì)應(yīng)的單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF) 紫外-可見吸收光譜的測(cè)定

分別稱量4種中間體5 × 10-3mmol，溶解于10 mL CH2Cl2中，配成500 μmol/L溶液。然后取100 μL該溶液用CH2Cl2稀釋成1 mL即得到待測(cè)樣品溶液。配合物樣品溶液的配制方法同上。

2 結(jié)果

2.1 單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的合成過程

中間體配合物[(phen)2Ru(pq)] Cl2與相應(yīng)的3,6位含有芳香基取代的鄰苯二胺在含有乙酸的乙腈溶液中回流發(fā)生縮合反應(yīng)得到4種對(duì)應(yīng)的目標(biāo)配合物。而鄰苯二胺衍生物是首先通過典型的Suzuki 偶聯(lián)反應(yīng)，即4,7-二溴苯并噻二唑與硼酸類似物在(PPh3)4做催化劑，堿性條件下回流得到4,7-呋喃苯并(1,2,5)噻二唑。該物質(zhì)再經(jīng)CoCl2催化，NaBH4還原得到對(duì)應(yīng)的3，6-二(2-呋喃基)鄰苯二胺。最后，本研究對(duì)中間體和配合物進(jìn)行了1H NMR、13C NMR和TOF-Mass的表征，詳見圖2。

2.2 芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)的紫外-可見吸收光譜

4種苯并噻二唑衍生物的紫外-可見光吸收光譜如圖3。盡管4種中間體在結(jié)構(gòu)上不同，它們?cè)诙燃淄槿芤褐械奈展庾V形狀相似。在280～300 nm處出現(xiàn)一個(gè)狹窄的吸收，歸屬于芳香環(huán)部分的π-π*躍遷，440～460 nm 處寬的吸收帶來源于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(intramolecular charge transfer,ICT)，即電荷從芳香基取代基轉(zhuǎn)移到苯并噻唑部分。另外，隨著共軛體系的增長(zhǎng)，這兩個(gè)吸收帶均發(fā)生了紅移。比較中間體F和T，低能級(jí)吸收帶的最大吸收波長(zhǎng)略有紅移，這可能是雜原子不同的供電性造成的。相似的現(xiàn)象可以在比較BF和BT中觀察得到。在高能級(jí)吸收帶沒有看到明顯的該特點(diǎn)。

圖2四種中間體(T、F、BT和BF)及對(duì)應(yīng)的[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的合成路線

Fig.2Thesyntheticroutesoffourintermediates(T、F、BTandBF)andtheircorresponding[(phen)2Ru(dppz)]2+derivatives(Ru-T、Ru-F、Ru-BTandRu-BF)

Reaction conditions: 1) boric acid analogues, Pd(PPh3)4, K2CO3, dioxane/H2O (4/1), reflux; 2) NaBH4, CoCl2, EtOH, reflux; 3) [(phen)2Ru(pq)]Cl2, CH3CN, HOAc, reflux；Ru-T：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-F：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-BT：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine；Ru-BF：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-[3,2-a:2′,3′-c]phenazine).

圖3芳香基取代的苯并(1,2,5)噻二唑類中間體(T、F、BT和BF)在CH2Cl2中的紫外-可見吸收光譜(50μmol/L)

Fig.3UV-visabsorptionspectraof4,7-diaryl-2,1,3-benzothiadiazoles(T、F、BTandBF)inCH2Cl2(50μmol/L)

T：4,7-bis(2-thienyl)-2,1,3-benzothiadiazole；F：4,7-bis(2-furanyl)-2,1,3-benzothiadiazole；BT：4,7-bis[2-benzo(b)thienyl]-2,1,3-benzothiadiazole；BF：4,7-bis[2-benzo(b)furanyl]-2,1,3-benzothiadiazole.

2.3 單核[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF)的紫外-可見吸收光譜

4種[Ru(phen)2(dppz)]2+衍生物在水中的UV-Vis吸收光譜詳見圖4。由圖可以看出，4種配合物具有相似的吸收光譜，主要包括4個(gè)特征吸收譜帶。在最大吸收波長(zhǎng)265 nm處有個(gè)強(qiáng)而窄的吸收，歸屬于兩個(gè)輔助配體鄰菲羅啉的π-π*躍遷；最大吸收波長(zhǎng)450 nm處寬峰是典型的金屬到配體的電荷轉(zhuǎn)移(metal to ligand charge transfer,MLCT)產(chǎn)生的吸收；375 nm強(qiáng)度適中的譜帶來源于dppz配體長(zhǎng)軸 π-π*躍遷。與母體配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+相比，dppz配體的10,13-位被兩個(gè)芳香基團(tuán)取代，375 nm 處dppz配體 π-π*躍遷導(dǎo)致的最大吸收波長(zhǎng)略有紅移，與MLCT吸收帶發(fā)生部分重疊。來源于芳香基取代dppz配體的縱軸方向上的315 nm處π-π*躍遷在Ru-T，Ru-F和Ru-BF中相似，和Ru-BT相比略有藍(lán)移，這可能是由整個(gè)分子的極性及共軛效應(yīng)決定的。 Ru-F的315 nm處吸收強(qiáng)度比Ru-T、Ru-BT和Ru-BF低，可能歸因于配合物在水中的π堆積效應(yīng)。

圖44種[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物(Ru-T、Ru-F、Ru-BT和Ru-BF在水中的紫外-可見吸收光譜(150μmol/L)

Fig.4UV-visabsorptionspectraoffour[(phen)2Ru(dppz)]2+derivatives(Ru-T,Ru-F,Ru-BTandRu-BF)inwater(150μmol/L)

Ru-T：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-thienyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-F：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-di(2-furanyl)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c) phenazine；Ru-BT：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo thienyl)]-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine；Ru-BF：ruthenium bis(phenanthroline)-10,13-[4,7-bis(2-benzo furanyl)]-pyrido-[3,2-a:2′,3′-c]phenazine)；[(phen)2Ru(dppz)]2+：ruthenium bis(phenanthroline)-pyrido-(3,2-a:2′,3′-c)phenazine.

3 討論

自從明星配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+作為優(yōu)良的DNA光開關(guān)被發(fā)現(xiàn)，化學(xué)家們開始對(duì)該配合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，努力探索出分子結(jié)構(gòu)與DNA作用動(dòng)力學(xué)的關(guān)系，為開發(fā)出新型DNA探針及抗腫瘤藥物奠定重要的基礎(chǔ)。本論文通過化學(xué)合成方法制備出了dppz配體10,13-位由兩個(gè)芳香基取代的4種[(phen)2Ru(dppz)]2+衍生物，并對(duì)苯并噻唑類中間體、目標(biāo)配合物進(jìn)行了核磁共振和質(zhì)譜的表征。文獻(xiàn)[20]報(bào)道的鄰苯二胺類物質(zhì)在空氣中極其不穩(wěn)定，通常是除去溶劑后直接用于下步反應(yīng)。本研究對(duì)于不穩(wěn)定的鄰苯二胺衍生物通過快速溶解樣品于經(jīng)K2CO3過濾的氘代氯仿中，得到了該化合物的核磁共振圖譜及質(zhì)譜。同時(shí)，4種配合物具有與母體配合物相似的紫外-可見吸收光譜，進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)配合物結(jié)構(gòu)。目標(biāo)配合物與DNA的相互作用目前在研究中，有望為開發(fā)出新型DNA探針及基于DNA鍵合的藥物奠定一定的理論基礎(chǔ)。